基于Dim env-YOLO算法的昏暗场景车辆多目标检测

低照度的夜间路况复杂,现有夜间车辆识别相关研究较少,且存在识别方法实时性不高、过多占用硬件资源等不足。针对夜间场景车辆识别干扰因素较多、检测效果不佳的问题,提出一种基于YOLOv4的Dim env-YOLO车辆目标检测算法。利用MobileNetV3网络替换原始YOLOv4中的主干网络,以减少模型参数量。在改进的YOLOv4模型上使用图像暗光增强方法,提高车辆目标在昏暗环境中的可识别性。在此基础上,引入注意力机制加强特征信息选择,同时利用深度可分离卷积降低网络计算量。选取北京部分道路的夜间场景图片自制数据集并进行实验验证,结果表明,在存在高斯噪声、模糊扰动、雨雾夜晚等情况下,Dim env-YOLO算法的测试结果较稳定,对于照度低于30 lx的昏暗条件下的车流,其检测mAP值达到90.49%,对于最常见的轿车类别,mAP值达到96%以上,优于Faster-RCNN、YOLOv3、YOLOv4等网络模型在昏暗光照条件下的检测效果。

1株J亚群禽白血病病毒env基因克隆及生物信息学分析

【目的】通过生物信息学方法分析1株禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)的囊膜蛋白env的分子特征。【方法】利用鸡成纤维细胞(DF-1)培养疑似禽白血病病鸡的血清样品,通过ELISA和实时荧光定量PCR鉴定ALV亚群。对env基因PCR产物进行测序,利用SeqMan拼接env基因。将该env基因与国内外多个ALV亚群进行序列比对及遗传进化分析,并借助多种生物信息学软件对env蛋白进行分析,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、乙酰化位点、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位预测。【结果】ALV-J毒株的env基因全长1719 bp,获得GenBank登录号为OP837418,其与J亚群ALV位于同一进化分支,相似性为89.3%~94.8%。该env蛋白有2个跨膜区,是由572个氨基酸组成的不稳定的亲水蛋白,不稳定系数预测值为43.49,总平均亲水性为―0.201;该env蛋白为非分泌蛋白,无信号肽,有17个N-糖基化修饰位点、77个O-糖基化修饰位点、42个磷酸化修饰位点、21个潜在抗原决定簇和9个连续碱基数超过10个的B细胞线性表位。该env蛋白的二级结构中无规则卷曲占比最大,为38.29%。【结论】env基因是导致ALV遗传变异的关键基因,其编码的囊膜蛋白env具有不稳定性,存在多个蛋白修饰位点和抗原表位。

贵州地区威宁鸡禽白血病病毒分离鉴定及env基因遗传进化分析

为了对贵州省纳雍县某养殖场发病威宁鸡种鸡进行禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的分离鉴定及env基因遗传进化分析,试验对送检的病死鸡进行临床症状和剖检病变观察,以及采集发病鸡肝脏进行细菌分离、ALV分离、ALV p27抗原的ELISA检测和病毒PCR鉴定,进一步对分离株的env基因进行克隆、测序,与GenBank收录的其他ALV参考株进行序列比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:剖检可见病死鸡腹腔中及肝脏上有肿瘤结节;取病死鸡的肝脏、心脏接种于含5%新生牛血清的TSA培养基和麦康凯琼脂培养基培养24 h,未见有细菌生长;取病死鸡肝脏组织,处理后接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)细胞,用ALV ELISA抗原检测试剂盒检测发现ALV p27抗原呈阳性;用ALV-J亚群env基因引物进行PCR检测,结果呈阳性,PCR产物大小约为924 bp;将分离毒株命名为ALV-GZ株,该毒株与国内外分离的ALV-J亚群的核苷酸相似性为97.0%~99.4%,与国内外分离的其他亚群的核苷酸相似性为50.8%~53.0%,与AHFX/16916株(GenBank登录号为MF614031.1)处于同一遗传进化分支,亲缘关系最近。说明贵州省纳雍县某养殖场发病威宁鸡种鸡感染了ALV-J亚群,且ALV-J亚群毒株在缓慢的变异演化中向地方品系鸡蔓延传播。

HIV-1 env基因在重组鸡痘病毒中的表达

在以鸡痘病毒复制非必需区TK基因为侧翼构建的载体 (插入有 16个串联的突变型痘苗病毒P7 5启动子和牛痘病毒A型包涵体晚期启动子及LacZ报告基因 )中的复合启动子下游 ,分别插入编码人免疫缺陷病毒(HIV)Ⅰ型外膜蛋白的env基因和中国株HIV 1gp12 0基因 ,通过与野生型鸡痘病毒的同源重组 ,X gal显色挑斑 ,获得 2株重组病毒vUTA - 2f- 16LE和vUTA - 2f- 16LG。经Dot-ELISA、免疫荧光试验、SDS -PAGE和Westernblot检测表明 ,2株重组病毒均能表达gp16 0和gp12 0 ,相对分子质量分别为 16 0 0 0 0和 12 0 0 0 0。经小鼠免疫试验其血清中抗gp12 0抗体A值和脾脏CD4+ /CD8+ T淋巴细胞比值均高于对照组 (P <0 .0 1) ,说明由重组病毒表达的Env蛋白和Gp12 0蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。

禽网状内皮组织增生症病毒env蛋白的表达及其在ELISA方法中的应用

以pb101质粒为模板,PCR扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜糖蛋白env基因片段。构建原核表达质粒pGEX-4T-3-env后,转化入宿主菌BL21,IPTG诱导表达env蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果表明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性,相对分子质量约66.4 ku。将表达产物纯化后作为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法(Ienv-ELISA)。经应用表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性,与IFA及iREV-ELISA结果相比其准确率均超过90%。该方法为检测REV抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段。

禽白血病病毒J亚群囊膜蛋白env基因的克隆和表达

禽白血病病毒J亚群 (ALV J)是 90年代鉴定出的ALV的新亚群 ,其囊膜蛋白env基因序别与ALVA E亚群有相当大的差别。为研究ALV Jenv基因及其表达产物的特点 ,用PCR方法扩增出ADOL 4817毒株的env基因 ,并克隆进TA载体 ,经电泳鉴定大小为 1 7kb。将克隆出的env基因与杆状病毒pBlue Bac4表达质粒DNA连接 ,构建成转移性载体 pBac4817env ,通过与Bac N Blue杆状病毒DNA共转染 ,获得了重组病毒rBac4817env 2。该重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,能高效表达env基因产物。免疫荧光分析结果证明 ,单克隆抗体G2或多价兔抗envgp37血清能识别Sf9细胞中重组env基因表达的特异性抗原 ;Westernblotting分析结果表明 ,表达的重组基因产物的分子量大小约为 90kD～ 94kD。用这些重组基因产物免疫鸡可以诱导鸡产生出高滴度的抗ALV J特异性抗体。这一结果提示 ,这种杆状病毒表达的重组基因产物有助于ALV

鸡痘DNA疫苗pVAX-env的构建及其体内外表达

利用PCR技术将鸡痘病毒env基因亚克隆到pVAX1真核载体上,构建了含有该基因的真核表达质粒pVAX-env。将质粒pVAX-env体外瞬时转染BHK21细胞通过间接免疫荧光检测蛋白表达。将pVAX-env质粒肌肉注射免疫14日龄雏鸡,通过RT-PCR和组织免疫荧光检测体内质粒表达。结果表明,成功构建了真核表达质粒pVAX-env,并证明pVAX-env在体内体外都能有效表达。研究为鸡痘病毒基因工程疫苗进一步研制及应用奠定了基础。

广西凭祥斗鸡禽白血病病毒检测及分离株env基因分析

为了解广西凭祥市特有家禽品种斗鸡禽白血病病毒（ALV）的感染情况,采集了该市3个鸡场斗鸡的肛拭子、血清、血浆样品共344份,用禽白血病ELISA检测试剂盒进行检测。结果显示,斗鸡ALV感染情况严重,其中肛拭样品ALV-p27抗原阳性率高达39.13%,血清样品病毒分离阳性率为12.97%,ALV-J和ALV-A/B抗体阳性率分别为22.39%和7.46%;对从2只斗鸡获得的病毒分离株DJ-3-18和DJ-45进行病毒囊膜蛋白基因env的扩增、序列测定及比较分析,结果显示2株病毒的gp85基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为88.2%～96.5%,gp37基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为91.4%～98.0%,其中与台湾A亚群蛋鸡源分离株TW-3577的亲缘关系最近,而与ALV其他亚群毒株的同源性则较低。结果表明,首次获得的2株斗鸡源ALV分离株属A亚群。

重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的 :构建新型的马传染性贫血病毒 (EIAV)的候选疫苗。方法 :利用BAC To BAC杆状病毒表达系统 ,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗 (EIAVDLV)及其亲本株 (EIAVLN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后 ,得到的重组病毒用SDS PAGE和Westernblot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAVenv基因的重组痘苗病毒 ,单独或与重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白联合免疫小鼠。结果 :构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比 ,联合免疫组免疫应答显著增强 ,其中中和抗体的滴度提高5～ 9倍。结论 :含有EIAVenv基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫 ,能够诱导高滴度的中和抗体。

禽白血病病毒J亚群env基因产物的抗原性分析

用PCR扩增方法将ALV Jenv基因不同片段进行了克隆 ,并构建了env基因片段GST融合蛋白载体。用Westernblot实验证明 ,大肠杆菌表达的不同env基因片段的GST融合蛋白能与相应的单克隆抗体产生特异性反应性 ,单克隆抗体JE9和G2识别的抗原位点位于gp85的氨基酸 6 5～ 1 5 5区域 ,而I45识别的抗原表位位于env基因的另一区域 (1 5 6～ 2 3 3位氨基酸 )。ALV J氨基酸多肽而非糖基化位点决定ALV

绵羊肺腺瘤内、外源性env基因比较分析

绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA)是由绵羊肺腺瘤反转录病毒(Jaagsiekte retrovirus,JSRV)感染引起的成年绵羊的一种慢性、进行性、接触传染性肺脏疾病。env是JSRV的主要毒力基因之一,而在正常羊的基因组中也存在着JSRV的内源性基因片段。为比较分析JSRV内、外源性env的特征,本文扩增并测定了正常绵羊肺组织的内源性env基因(Enenv),运用生物信息学技术,比较分析了其与外源性绵羊肺腺瘤病毒JSRV21(AF105220)env基因(Exenv)的遗传进化关系,二、三级蛋白结构和抗原表位。结果表明Enenv和Exenv核苷酸同源性为88.1%,推导的氨基酸同源性为92.0%,两者的主要差异位于TM区和YXXM基序。本结果为进一步研究JSRVenv基因功能提供了新线索。

HIV-1 env基因序列分析及其与长期感染不进展现象相关性研究

目的研究HIV-1长期感染不进展现象与HIV-1 env基因变异的关系。方法用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)对21例感染HIV-1毒株7年以上者外周血单一核细胞(PBMCs)的核酸样本进行扩增,获得HIV-1膜蛋白(env)基因的核酸片段,对其C2-V3及邻区350-450个核苷酸序列进行测定和分析,所得结果与HIV-1该亚型国际标准株进行比较,分析共享序列及突变序列,制作系统树,计算离散率。结果离散率和系统树分析21个毒株均为HIV-1 B亚型,毒株间基因离散率在2%左右,高于前期研究结果;未见V3环顶端四肽特征性GPGR和GRGQ,也未见前期研究曾经发现的脯氨酸向异亮氨酸的变异现象。结论HIV-1长期感染者体内毒株env基因无规律性突变。

云南瑞丽县IDUs人群HIV-1感染者毒株env基因C2-V3区序列的测定

1目的 了解云南瑞丽县 1994年以后静脉药瘾 (IDU s)人群 HIV- 1感染者分离株的分子流行病学特征。 2方法 运用套式聚合酶链反应扩增 HIV- 1env基因 C2 - V3区 ,将扩增片段纯化后与 p EGM5 zf(+)载体连接 ,再克隆入大肠杆菌 ,提取重组质粒 ,使用 DNA自动测序仪进行序列测定。 3结果 与此地区 1989年分子流行病学资料比较 ,V3区变异不显著 ,未发现新的亚型与毒株。 4结论 5株 HIV- 1毒株进化关系非常密切 ,这一地区IDUs人群中 HIV- 1的流行毒株仍以美欧 HIV- 1SF2株为主。

禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及其多克隆抗体制备

为原核表达禽网状内皮组织增生症病毒(REV)env蛋白及制备抗env蛋白的高效价多克隆抗体,本研究以pMD18T-env(HLJR0901株)为模板,扩增得到REV的env全长基因,将其克隆于pET-32a(+)中。将阳性重组质粒pET-env转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,复性后免疫BALB/c小鼠,制备抗env多克隆血清。SDS-PAGE及western blot结果表明,env基因以融合蛋白形式获得正确表达,相对分子质量约为84ku,表达产物具有良好免疫原性;IFA结果显示,制备的抗env多克隆血清能与REV野毒株特异性反应;ELISA效价达到1∶105以上。该研究为REV的检测及env蛋白的深入研究奠定了基础。

HIV-2 env基因在大肠杆菌和重组痘苗病毒中的表达

将编码人Ⅱ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－２）ｅｎｖｇｐ１２０（Ｅ１）和ｇｐ３６（Ｅ２）分别克隆到原核高效表达载体ｐＥＴ１７ｂ、ｐＢＶ２２０和真核表达载体ｐ１０、ｐ１６中，构建成８个重组质粒。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，在原核表达系统成功地表达了ＨＩＶ－２ｅｎｖ融合蛋白，表达的蛋白分子量分别为３５０００、７００００和５００００，而原核表达质粒ｐＥＴＥ１在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶的３５０００处可见明显的额外蛋白带。经薄层扫描测定，原核系统表达的Ｅｎｖ蛋白（ｇｐ１２０）相对含量为５．８％。在真核细胞中表达的Ｅｎｖ蛋白经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测分析，分子量分别为６００００、５７０００和４２０００。上述表达的Ｅｎｖ蛋白均能与ＨＩＶ－２阳性血清发生特异性反应。

HIV-1SF2株env基因(120)在大肠杆菌中的表达

运用基因重组技术，将ＨＩＶ－１ＳＦ２株编码外膜蛋白ｇｐ１２０的ｅｎｖ基因片段与原核载体ｐＢＶ２２０进行重组，构建成质粒ｐＢＶＳＦ２ｅｎｖ，并在肠杆菌（ＥＣｏｉｌＤＨ１０ｂ）中获得表达，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ反应证实，该重组蛋白可与来自ＨＩＶ－１感染者的血清（含多克隆抗体）发生特异性反应。

A亚群禽白血病病毒env基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为获得A亚群禽白血病病毒(ALV-A)env基因的表达产物,以ALV-A AH10毒株病毒RNA为模板,通过反转录PCR扩增得到env基因,将其克隆到转移载体p Fast Bac1中,转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒r Bacmid-env A,r Bacmid-env A转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blot)结果显示,重组蛋白可与抗ALV-A抗体发生特异性反应,重组蛋白分子大小约为90 000,与预期大小相符,表明env基因在Sf9细胞中获得了良好表达。

受血及献血者HIV-1外膜蛋白ENV基因序列分析

目的 了解在广东省受血及献血者中发现的HIV 1亚型的流行规律及其与国际参考株的同源性。方法 应用套式聚合酶链反应 (PCR)对 1 4例采自于广东省HIV 1抗体阳性的受血者或献血者淋巴细胞富集液的核酸样品进行扩增 ,并使用ABI377型测序仪对扩增产物测序后 ,对其ENV基因C2 V3段的核酸序列进行比较分析。结果 1 4份血样中 ,7份为泰国B’亚型 ,与国际参考株RL4 2的距离最近 ,基因离散率为 (6 0 82± 2 6 0 7) % ,组内离散率为 (5 96 3± 2 383) % ;4份为AE重组亚型 ,与国际参考株TH 90 CM2 4 0最近 ,基因离散率为 (8 90 0± 1 830 ) % ,组内离散率为 (1 3 81 0± 1 31 7) % ;2份为 0 7 BC重组亚型 ,与国际参考株CN 97 C5 4A最近 ,基因离散率为 (4 1 5 5± 1 2 2 3) % ,组内基因距离为 6 36 % ;1份为 0 8 BC重组亚型 ,与国际参考株 97CNGX 9F最近 ,基因距离为 0 97%。结论 本次检测的广东省受血及献血者HIV 1以泰国B’亚型为主 ,也存在主要在性途径感染人群中流行的AE重组亚型和吸毒者中流行的 0 7 BC、0 8 BC重组亚型。

HIV-1 gag和env基因片段的构建及表达

为研究人免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子生物学，发展艾滋病的诊断试剂，克隆了含HIV－1env和gag基因cDNA的质粒pUCF12。用PvuⅡ和HincⅡ降解pUCF12质粒，得到含部分p17、全部p24和全部p15基因的cDNA片段，用BglⅡ降解pUCF12质粒得到含有部分gp120和全部gp41的cDNA片段。将该两个片段分别亚克隆到表达载体PGex上，在pTac启动子的调控下，部分gag基因和env基因在大肠杆菌中表达．在SDS－PAGE中，GST＋gag融合蛋白呈现一条约70kD的染色带，其表达水平约占菌体总蛋白的18％．而GST－env蛋白则呈现一条约65kD的蛋白带，该表达蛋白约占菌体总蛋白的15％。经免疫印迹分析，该两种表达产物可分别与抗-P24和抗-gP41的单克隆抗体反应，用Abbott试剂也证明为HIV－1抗原蛋白。