深海嗜热噬菌体GVE2头尾连接蛋白EV8的原核表达和功能分析

为了解头尾连接蛋白在噬菌体感染和装配中起的作用,对高温噬菌体GVE2(virulent bacteriophage ofGeobacillus sp.E263)的头尾连接蛋白EV8进行了原核表达和功能鉴定.将EV8编码序列克隆入pGEX4T-2原核表达载体,并转染大肠埃希氏菌BL21.诱导表达后用SDS-PAGE进行鉴定,显示获得相对分子质量约36kD的谷胱甘肽硫转移酶(GST-EV8)融合蛋白.Western blot检测发现EV8在GVE2感染后2 h开始表达,说明该蛋白为噬菌体晚期表达蛋白.免疫电镜定位表明头尾连接蛋白位于噬菌体头尾的连接处,为进一步研究高温噬菌体的组装和表达调控奠定了基础.

马疱疹病毒8型gD蛋白的生物信息学分析及多克隆抗体制备

旨在探索马疱疹病毒8型(Equine herpesvirus type 8,EHV-8)囊膜蛋白gD的生物信息学特性、原核表达和多克隆抗体制备。用生物信息学分析软件对gD基因编码蛋白质的理化性质、亲/疏水性和跨膜区进行分析,以EHV-8 SDLC66毒株为模板,通过PCR扩增gD蛋白的胞外区并克隆至pET-32a(+)载体中,将重组质粒pET-32a-gD转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,收集菌体超声破碎,纯化并获得重组gD蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,用间接ELISA测定所制备多克隆抗体的效价,同时用Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)明确所制备多克隆抗体的特异性。结果表明,EHV-8 gD编码的蛋白稳定,是亲水性蛋白,有跨膜区,位于30-330 aa。gD蛋白跨膜区正确克隆入pET-32a(+)载体,获得重组质粒pET-32a-gD。重组gD蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,分子质量约为55 ku,将其纯化后免疫新西兰兔获得抗gD多克隆抗体,该抗体的效价高达1∶200 000,Western blot与IFA结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。