密码子优化的HPV16 L2E7基因在大肠杆菌中高效表达

目的提高HPV16L2E7融合基因在大肠杆菌中的表达水平,为中试研究提供高表达量的疫苗候选株。方法根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对L2E7全基因进行密码子优化,将分段合成的基因分部插入到pET9a中,经酶切和测序鉴定无误后转化BL21(DE3+)中,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的融合蛋白进行SDS-PAGE胶和Western blot鉴定。同时还进行梯度实验分别对诱导的温度、时间和IPTG诱导时菌体浓度进行优化,并对蛋白的纯化方案进行摸索。结果优化后的pET9aSL2E7AB在大肠杆菌中得到高效表达,诱导条件优化后的目的蛋白占全菌60%左右。结论成功得到了具有较高表达水平的疫苗候选株。

鹅MyoG基因外显子1的克隆及序列分析

肌细胞生成素（myogenin，MyoG）是生肌调节因子MRFs（MyoD、MyoG、Myf5和MRF4）家族的一员，它的表达具有控制成肌细胞融合的起始，促使成肌细胞增殖的作用，使单核成肌细胞转变成为多核的肌纤维，在MyoD家族中具有中心地位。本试验克隆了鹅MyoG外显子1序列，得到其片段长度为438bp，与鸡MyoG基因的同源性为91．9％，与人、牛、猪等哺乳动物同源性为68％-70％，其氨基酸序列与鸡的同源性达到93．8％。核酸进化树显示，鹅、鸡较早地与哺乳类动物分化开来。分析了该区域编码氨基酸的亲水性、相应区域位于表面可能性和平均电荷，以及密码子的使用策略。

肝癌组织内乙型肝炎病毒基因组前C区终止密码的发现

用聚合酶链反应(PCR)在3例乙型肝炎病毒(HBV)C基因阳性的原发性肝癌(HCC)组织中扩增和克隆了HBV C基因片段(部分前C区和全部C区),获得了重组质粒pHBC_1,pHBC_2,pHBC_3。将重组质粒中HBV C基因亚克隆至M_(13)DNA序列测定系统,用双脱氧法测定了HBV C基因片段的核苷酸序列。在2例HCC中,发现前C区第1898位核苷酸点突变,结果形成了终止密码。在3例HCC中,C区也发现有核苷酸点突变,其中部分可致编码氨基酸改变。

γ-环糊精糖基转移酶在毕赤酵母中高效表达

本论文通过密码子优化、表达质粒的比较、发酵条件优化,将来源于Bacillus pseudalcaliphilus的环糊精糖基转移酶基因在毕赤酵母中高效表达。在诱导初始p H 6.0、发酵温度28℃、接种量6%、甲醇添加量1%时,γ环化活力最终达到了83.65 U/m L,比活力296.49 U/mg。通过硫酸铵分步沉淀法即可有效将上清粗蛋白盐析制备,得到68.28%γ-环糊精糖基转移酶。

VDR基因启动子单核苷酸多态性与前列腺癌的关系

目的了解维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因启动子上存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与前列腺癌的关系,进而探讨导致前列腺发病的遗传因素。方法提取60例前列腺癌及50例良性前列腺增生患者外周血标本中基因组DNA,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测并分析了VDR基因起始密码SNP在两组中的分布。常规病理方法分析前列腺癌的Gleason评分。对比分析VDR基因上存在的SNP与前列腺癌发生发展的相关性。结果前列腺癌组和前列腺增生组FokⅠ等位基因多态性分布差异有统计学意义(P<0.05),高危组和低危组前列腺癌中VDR基因SNP分布的的差异有统计学意义(P<0.05)。结论VDR基因起始密码SNP不同类型可能与前列腺癌的发生有相关性。不同SNP类型可能成为前列腺癌发展的危险因素。

PCR-RFLP检测维生素D受体基因启动子区多态性

目的建立一种简便、实用、重复性好的人维生素D受体(vitamin Dreceptor,VDR)基因5′端启动子区Fok1酶切位点多态性的检测方法,以利于VDR基因起始密码多态性与骨质疏松等疾病相关性的研究。方法应用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增VDR基因5′端启动子区,扩增产物用限制性内切酶Fok1酶切,10%聚丙酰胺凝胶电泳观察酶切结果。结果应用PCR-RFLP法检测了98例健康汉族中老年人VDR基因型,FF、Ff、ff基因型分布频率分别为47%、43%、10%。结论该方法简便、准确、实用,适用于院校及医院实验室的研究和分子流行病学调查。

嗜酸热古菌病毒STSV2密码子偏嗜性及其对dUTPase外源表达的影响

病毒和宿主之间的密码子使用频率差异是病毒在宿主中生存的重要调控机制之一。利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计病毒STSV2及其宿主Sulfolobussolfataricus P2中的6个不同基因的遗传密码偏嗜性,并对病毒STSV2的dUTPase在大肠杆菌BL21和Rosetta中分别进行外源表达并分析其差异。结果表明,病毒STSV2密码子的偏嗜性总体与其宿主菌P2相似,STSV2基因组的不同蛋白编码基因的密码子偏嗜性有区别,病毒和宿主的相似蛋白编码序列密码子偏嗜性也有差异。分别以BL21(DE3)和Rosetta(DE3)为宿主表达STSV2的dUTPase基因显示,以BL21(DE3)为宿主时表达量大于以Rosetta(DE3)为宿主时目的蛋白表达量,进一步说明了病毒STSV2的密码子的偏嗜性对其蛋白的外源表达影响。

基于密码子使用模式的冠状病毒亲缘关系分析

SARS冠状病毒是一种新的冠状病毒,已经被确定为引起SARS即非典型肺炎的病原体.本文提出了一种基于密码子使用模式的冠状病毒亲缘关系研究方法.即是选择冠状病毒基因组中RdRp基因的密码子使用率代表该病毒,来计算物种之间的进化距离,并以此构建了冠状病毒亲缘树.而在单独分析SARS冠状病毒和类SARS冠状病毒的亲缘关系时,我们用这些病毒基因组全部基因序列的密码子使用率代表该物种,来计算它们之间的进化距离,构建了只包含源自于不同时期不同病原体的SARS冠状病毒和类SARS冠状病毒的亲缘树.以上两项工作基本上反映了SARS冠状病毒与原有冠状病毒之间的亲缘关系,同时也揭示了SARS冠状病毒自身的进化过程.

基于拟氨基酸编码方法的同义密码子的偏好性与结合强度的相关性研究

计算了基于拟氨基酸编码方法下的同义密码子的相对使用度,分析了78个人类基因(19967个密码子)中基于拟氨基酸编码方法下的同义密码子的偏好使用情况.石秀凡等的研究结果显示了人类基因中基于基因组基因编码方法下,对同义密码子的选择在所有密码子家族中仍都呈现明显一致的偏好.即偏好使用密码子-反密码子结合作用强的密码子,恰好是以c结尾的密码子;且避免使用结合作用中度的密码子.依据结果和数据分析,推测人类基因对密码子的选择除了受基因组结构中isochore和基因签名的影响外,还和密码子-反密码子结合强度密切相关.这些因素共同作用于人类基因,从而在所有密码子家族中都呈现出对同义密码子明显一致的偏好现象.文中则是展示了上述性质在拟氨基酸编码方法下,这些特征不但存在,而且更为明显.

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。

ABO基因c.2T>C突变致GTA翻译异常引起的A_xB表型一例及机制分析

目的:对1例ABO正反定型不一致患者的血标本进行鉴定,并探索其潜在的分子机制。方法:血清学标准方法鉴定ABO血型,并进行血浆总体A糖基转移酶(glucanotransferase,GTA)活性测定。对ABO基因7个外显子及其侧翼序列行PCR扩增、直接测序或克隆后测序分析。结果:本例血清学鉴定为A_xB亚型;血浆总体GTA活性明显下降(效价为±);ABO基因外显子1的第2位核苷酸存在T>C错义突变。结论:ABO基因c.2T>C突变导致翻译起始位点被跨膜结构域或茎区域中的Met替代,从而形成N端截短的GTA的表达,进而引起此例患者A_xB表型。