EOLA1基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressedlipopolysaccharide associatedfactor1,EOLA1)基因5′侧翼区的调控序列。方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5′侧翼区不同长度的片段,插入β半乳糖苷酶(βgal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的βgal调节活性。结果含EOLA1基因5′侧翼区-1～-2659bp和-1～-1951bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现βgal上调活性,而-1～-361bp序列的重组质粒活性无明显变化。结论EOLA1基因5′侧翼区-361～-1951bp内存在基因转录启动子元件。

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLA1的转录调控机制奠定基础。方法通过PCR反应进一步缺失突变EOLA1基因5′侧翼区-1672～+51(1723bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性。采用生物信息学分析该1723bp片段可能存在的转录因子结合位点。结果缺失到785bp片段仍具有启动子活性,进一步缺失到717bp片段后活性消失,从而确定启动子位于-738～-676bp序列,其附近含Sp1和Myf顺式作用元件。结论确定了EOLA1启动子范围和转录因子结合位点。

内皮活化相关新基因EOLA1的亚细胞定位及组织表达

目的 研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子 1(EOLA1)基因的亚细胞定位和组织表达特性 ,为对其进行进一步的功能研究打下基础。方法 构建EOLA1 EGFP(绿色荧光蛋白 )融合蛋白表达质粒 ,转染内皮细胞后瞬时表达 ,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1蛋白的亚细胞定位 ;通过人多组织Northern杂交研究EOLA1基因的组织表达。结果 EOLA1蛋白在正常人各组织中呈选择性表达 ,在人的心脏、骨骼肌、肾脏、肝脏和胎盘组织中有较强的表达 ,在结肠、脾脏和小肠中有较弱的表达 ,而在脑、胸腺、肺和外周白细胞中无表达 ;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆 ,少量表达于细胞核。结论 EOLA1属胞内蛋白 ,可能在细胞内信号转导中起着作用。

人新基因EOLA1生物信息学分析

目的预测人类新基因EOLA1的生物学功能。方法基于EOLA1全长cDNA序列,应用生物信息方法,从序列比对、染色体定位、基因结构分析、编码蛋白理化性质分析、蛋白质位点和序列模式预测等几个方面对EOLA1进行分析。结果EOLA1编码的蛋白EOLA1经网上同源性比对没有发现与之高度同源的人类已知蛋白;EOLA1与鼠111002L19蛋白高度同源,到目前为止,对鼠111002L19蛋白功能也不清楚;应用辐射杂交细胞系(RH)作图系统发现EOLA1定位于Xq27.4;对其二级结构进行预测发现在EOLA1蛋白分子中存在酪氨酸激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位点以及1个螺旋-转角-螺旋(HTH)基序。结论人新基因EOLA1编码蛋白质的一级和二级结构特征赋予EOLA1信号转导能力,有可能作为信号分子在LPS激活人血管内皮细胞的过程中发挥作用。

hEOLA1抗体的制备及肿瘤组织中EOLA1的表达检测

目的制备抗EOLA1多克隆抗体并检测其在肿瘤组织中的表达。方法采用原核表达获得EOLA1蛋白,纯化后作为抗原免疫大白兔,获得兔抗人EOLA1(hEOLA1)多抗血清,进行免疫组化检测人多肿瘤芯片上EOLA1的表达。结果制备了高滴度的hEOLA1多克隆抗体,免疫组化显示EOLA1蛋白在肺癌、结肠癌、胃癌和肝癌仅表达于肿瘤间质,肿瘤细胞本身未见表达,而在胶质瘤和乳腺癌则呈广泛表达。结论EOLA1可能在胶质瘤和乳腺癌的发生、发展方面起着重要作用。

eola1下调表达对ECV304细胞增殖的影响

目的 设计和构建人类新基因人内皮高表达脂多糖相关因子 1(endothelium overexpressedlipopolysaccharide as sociatedfactor1,eola1)特异性的小干扰RNA表达载体sieola1,建立eola1下调表达模型 ,观察eola1下调表达对细胞增殖的影响。方法 设计靶点特异性的寡核苷酸 ,连接到经BamHⅠ HindⅢ酶切线性化的pSlincer3 .1 H1质粒上 ;转染重组质粒到ECV3 0 4细胞 ,通过定量RT PCR实验检测靶基因的抑制情况 ;对转染sieola1质粒的细胞进行细胞计数 ,并应用流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果 构建的小RNA干扰质粒sieola1转染ECV3 0 4细胞能够抑制靶基因eola1的表达 ;细胞计数和流式细胞仪检测结果显示eola1表达抑制后 ,细胞生长周期延长。结论 成功构建了针对eola1基因的siRNA质粒 ;细胞计数和流式细胞仪检测结果初步确认eola1具有抑制ECV3 0 4细胞增殖的作用。

小干扰RNA表达载体介导的EOLA1基因表达抑制研究

目的 设计和构建EOLA1基因特异性的小干扰RNA质粒 ,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 将靶点特异性的寡核苷酸连接到经ApaⅠ EcoRⅠ酶切线性化的pBS/U6质粒 ,测序验证 ,阳性重组质粒转染ECV3 0 4细胞 ,半定量RT PCR方法检测靶基因的表达 ,阳性重组质粒与pEGFP EOLA1共转染 ,观察外源报告基因绿色荧光蛋白的表达。结果 构建的阳性重组质粒转染能够抑制靶基因EOLA1mRNA的表达 ,并能够显著抑制EOLA1 EGFP融合蛋白的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒 ,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

门静脉注射pSilencer质粒观察DA大鼠移植肝脏EOLA1的表达变化研究

目的观察EOLA1在大鼠移植肝脏中的表达和功能。方法采用近交系雄性DA大鼠60只,Lewis大鼠120只,分为3组,改良“二袖套”法建立肝脏移植模型90例。A组Lewis为供体(n=30),Lewis为受体;B组DA为供体(n=30),Lewis为受体;C组以DA大鼠为供体(n=30),Lewis为受体,受体肝在移植后于门静脉注射RNA抑制性干扰质粒。观察平均存活时间;术后1、3、5、7、10时相点血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBIL)水平以及移植肝脏的病理学变化;半定量检测EOLA1蛋白的表达变化。结果平均存活时间A组超过100d,B组(16.2±1.4)d,C组平均存活时间(11.8±1.6)d;术后第5天B、C组血清ALT和TBIL升高较A组非常显著(P<0.01),B组高于C组差异显著;B、C组病理检查为明显的炎性反应,A组不明显;A组移植肝组织EOLA1表达最高,B组次之,C组最低,B、C组与A组比较差异非常显著(P<0.01),B、C两组间比较差异显著(P<0.05)。结论EOLA1蛋白表达水平的高低与肝组织内炎症反应的严重程度存在负相关;门静脉注射pSilencer质粒可以明显的抑制EOLA1在移植肝脏的表达。

EOLA1多克隆抗体的制备及免疫定位

目的:制备兔抗人内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)多克隆抗体,探讨其在部分人体恶性肿瘤组织中的免疫定位。方法:构建重组质粒,转化大肠杆菌及诱导表达,抽提目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,免疫组织化学法检测EOLA1在部分人体恶性肿瘤组织中的表达。结果:成功制备重组质粒在大肠杆菌中表达人EOLA1蛋白,免疫家兔制备得到兔抗EOLA1多克隆抗体,免疫组织化学法检测显示EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达。结论:成功制备EOLA1多克隆抗体,证实EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达。

人类内皮活化相关新基因EOLA1真核表达载体的构建与鉴定

目的为筛选与新基因EOLA1(内皮高表达脂多糖相关因子1)相互作用蛋白,了解EOLA1基因功能奠定基础。方法应用菌液PCR技术,从贮存的含EOLA1基因全长cDNA的大肠杆菌DH5α中扩增其开放阅读框(ORF)序列,亚克隆到真核表达载体pGBKT7中,经酶切及测序进行验证。结果鉴定结果显示,EOLA1的ORF全部序列包含在所构建质粒的多克隆位点中,且序列比对完全相同,表明EOLA1真核表达载体构建成功。结论EOLA1基因真核表达载体的成功构建为进行蛋白质相互作用研究提供了有力的工具。

EOLA1基因突变体的克隆和鉴定

目的 对ECV3 0 4细胞株EOLA1基因进行克隆测序以及mRNA水平检测。方法 采用RT PCR扩增EOLA1基因片断 ,连接到T载体进行测序。结果 测序发现一种目的基因mRNA剪接突变体 ,其第 3外显子起始部分比Genebank数据库相应序列多出 19个碱基。RT PCR显示剪接突变体与野生型EOLA1基因具有不同的表达水平和LPS反应性。结论 发现一个EOLA1基因剪接突变体 。

EOLA1基因在DA大鼠移植肝脏急性排斥反应中表达的初步研究

目的:观察新基因EOLA1在DA大鼠移植肝脏中的表达情况。方法:采用近交系雄性DA大鼠30只,Lew is大鼠90只,分为AB两组,改良"二袖套"法建立肝脏移植模型60例。A组:移植耐受组(n=30),Lew is大鼠60只,30只为供体,30只为受体,建立30例肝脏移植耐受模型;B组:急性排斥组(n=30),DA大鼠30只为供体,Lew is大鼠30只为受体,建立30例肝脏移植急性排斥模型。观察平均存活时间;术后1、3、5、7、10天各时相点血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TB IL)水平以及移植肝脏的病理学变化;半定量检测EOLA1的表达情况。结果:平均存活时间A组超过100天,B组(16.2±1.4)天;术后第五天B组血清ALT和TB IL升高较A组非常显著(p<0.01);B组病理检查为明显的炎性反应,A组不明显;A组移植肝组织EOLA1表达较高,B组较低,两组比较相差非常显著(p<0.01)。结论:EOLA1基因表达水平的高低与移植肝组织急性排斥反应的的严重程度呈负相关,对大鼠移植肝脏急性排斥反应可能具有保护性调控意义。

刺激ECV304细胞增殖的新基因EOLA1的克隆和功能研究

目的扩增内皮细胞受内毒素刺激后上调表达的新序列标签ST55(GenBank No.BM121646)全长cDNA序列并研究其结构和生物学功能。方法应用快速扩增cDNA末端技术延伸ST55获得其全长cDNA序列,以Northern杂交检测其组织分布,通过酵母双杂交筛选其胞内相互作用蛋白,在ECV304细胞中稳定转染目的基因并强制表达后观察细胞生长变化。结果获得1个全长为1404碱基的cDNA序列,作为人类新mRNA被GenBank接受(AY074889),命名为内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressedlipopolysaccharide-associatedfactor1,EOLA1)。生物信息学分析显示EOLA1基因含5个外显子,定位于染色体Xq27.4,编码蛋白质由158个氨基酸组成,分子量为1789。Northern印迹显示EOLA1在人各组织和癌细胞系有不同的表达;以EOLA1cDNA作为诱铒,进行酵母双杂交筛选人肝cDNA文库,鉴定了金属硫蛋白2A(metallothionein2A,MT2A)为其相互作用蛋白并采用免疫共沉淀验证了这一结果。高表达EOLA1显著促进了ECV304细胞增殖。结论EOLA1是人内皮活化相关新基因,EOLA1与MT2A的相互作用可能在炎症反应中细胞内保护方面发挥作用。

转录因子Sp1在人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1基因转录中的作用

目的明确转录因子Sp1在人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysiccha-ride-associated factor 1,EOLA1)基因转录调控中的作用。方法定点突变EOLA1基因核心启动子-734～-666序列中推断的Sp1结合位点,观察启动子活性变化;进行凝胶电泳迁移和染色质免疫共沉淀验证Sp1转录因子与启动子区顺式作用元件发生相互作用。结果突变Sp1结合位点后,核心启动子的活性(0.12±0.01)较野生启动子(2.51±0.98)显著下降(P<0.05),EMSA和染色质免疫共沉淀验证了SP1与启动子区顺式作用元件相互作用。结论转录因子Sp1调控了EOLA1基因的基础转录。

内皮高表达脂多糖相关因子1抑制巨噬细胞炎症反应

目的本实验旨在观察内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)对巨噬细胞炎症反应的影响及可能机制。方法培养小鼠巨噬细胞,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激激活炎症信号通路,检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和EOLA1转录水平变化,采用化学阻断剂在不同位点阻断炎症反应信号通路,再检测TNF-α、IL-6和EOLA1转录变化。巨噬细胞过表达mEOLA1,RT-qPCR检测细胞M1、M2极化类型标志基因mRNA水平,以流式细胞术检测巨噬细胞表型改变,Western blot检测M1型巨噬细胞标记物iNOS表达。结果LPS刺激后巨噬细胞释放炎症因子TNF-α、IL-6增加,而EOLA1表达下调;不同位点阻断炎症反应信号通路后炎症介质的表达明显受抑制,而EOLA1的表达上升;在巨噬细胞中高表达EOLA1,再行LPS刺激,检测到TNF-α、IL-6增加并不明显,流式细胞检测显示高表达EOLA1的巨噬细胞在LPS刺激后仍保持非炎症极化的M2型,细胞表达iNOS下降。结论EOLA1具有负调节巨噬细胞炎症相关通路活化的作用,其表达增加可以促进巨噬细胞从促炎症的M1型向促愈合的M2型转变,减少局部炎症程度。

应用非吸收齿状线行无乳晕切口的乳房松垂矫治固定术

目的:探讨应用单丝聚丙烯合成非吸收齿状线进行无乳晕切口的乳房松垂矫治固定术。方法:对近两年28例的单丝聚丙烯合成非吸收齿状线进行无乳晕切口的乳房松垂矫治固定术中的应用进行总结与分析。结果:应用单丝聚丙烯合成非吸收齿状线行无乳晕切口的乳房松垂矫治固定术后,乳房松垂美容整形术的瘢痕并发症明显减少,效果加强,乳晕无瘢痕。结论:单丝聚丙烯合成非吸收齿状线进行无乳晕切口的乳房松垂矫治固定术中应用得当,可减少并发症、取得良好的预期效果。