NF-κ Bp65基因siRNA腺病毒载体的构建及其对EOMA细胞的影响

目的构建含NF-κ Bp65基因siRNA腺病毒载体,并研究其对小鼠血管瘤细胞EOMA中NF-κ Bp65基因表达的影响。方法首先构建含有NF-κ Bp65 shRNA的人H1启动子真核表达载体pSuperH1/shp65,利用NotⅠ与SalⅠ双酶切将人H1载体启动子和NF-κ Bp65 shRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle中,形成转移质粒pShuttle-H1/shp65,然后转化含有pAdeasy的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒Ad-shp65,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染小鼠血管瘤细胞EOMA,采用RT-PCR和荧光定量PCR检测感染前后NF-κ Bp65表达水平的变化,观察Ad-shp65对EOMA中NF-κ Bp65表达的影响。结果成功构建NF-κB p65 siRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制EOMA细胞中NF-κ Bp65的表达。结论构建的Ad-shp65腺病毒能有效抑制NF-κ Bp65基因在小鼠血管瘤细胞中的表达,为研究异种移植延迟性排斥反应提供了新的方法。

水蛭素对小鼠EOMA血管瘤细胞体外增殖及凋亡的影响

目的探讨水蛭素作用于小鼠EOMA血管瘤细胞的抑制作用及其机制。方法体外培养EOMA细胞,使用不同浓度水蛭素作用于EOMA细胞48 h,应用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术检测细胞存活率和细胞凋亡情况,观察水蛭素对EOMA细胞的抑制作用,并筛选出水蛭素的最适抑制浓度,比较水蛭素和平阳霉素(PYM)单用对EOMA细胞的抑制率。结果相较于溶剂对照组,EOMA细胞存活率随水蛭素浓度增加而逐渐下降,至药物浓度为4 U/ml时有显著差异(P<0.05)。结论水蛭素在体外可有效抑制小鼠EOMA血管瘤细胞的增殖并促进其凋亡,这一作用呈现明显的剂量效应关系。

利用siRNA抑制NF-κB p65蛋白表达对EOMA细胞中TF表达影响

目的探讨针对小鼠EOMA细胞核冈子KB（NF—KB）的小干扰RNA（siRNA）对细胞c}t组织因子（TF）表达的抑制作用。方法设计并化学合成针对小鼠NF—KBp65的siRNA，按照实验分组分别转染小鼠EOMA细胞，转染24h后，在相应细胞中加入肿瘤坏死因子α（TNF-α，终浓度为20mg／L），于此后6h分别提取各组细胞总蛋白及RNA，检测细胞内NF—KBp65蛋白表达和TF的mRNA水平。结果TNF-α．刺激6h后，与空白对照组相比，阴性对照组、scramblesiRNA组细胞内NF—KBp65蛋白表达和TFmRNA水半增加，而siRNA组则明娃受到抑制；TNF组、TNF＋scramblesiRNA组细胞内NF—KBp65蛋门表达和TF mRNA水平明显增加，TNF＋siRNA组细胞内NF—KBp65蛋白表达和TFmRNA水平较卒白对照组有所增加，但明显低下TNF纽、TNF＋scramblesiRNA组（P〈0．01）。结论利用siRNA抑制NF—KBp65蛋白表达可以有效地抑制NF—KB下游靶慕因TF的表达。

油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的抑制作用

目的:探讨油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的抑制作用。方法:选择小鼠血管瘤EOMA细胞作为实验对象,不同浓度油茶皂苷作用于EOMA细胞,采用CCK8法、AO染色及流式细胞术分别检测细胞增殖水平、细胞凋亡率及细胞周期分布。结果:油茶皂苷作用EOMA细胞24 h后,CCK8法检测油茶皂苷对EOMA细胞体外增殖能力有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。吖啶橙(AO)染色后荧光显微镜下观察可见细胞数量明显减少,细胞体积缩小,细胞核固缩,计数,与对照组相比,油茶皂苷20 mg·L^(-1)组、40 mg·L^(-1)组凋亡率分别为9.5%、14.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。经流式细胞仪检测,与对照组相比,油茶皂苷20 mg·L^(-1)组、40 mg·L^(-1)组细胞G0/G1期比例增加而S期比例降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:油茶皂苷可一定程度抑制血管瘤EOMA细胞的增殖,其作用机制可能是通过诱导EOMA细胞凋亡,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制其增殖转化。

干扰长链非编码RNA MALAT1对血管瘤EOMA细胞的生长、运动及小鼠体内肿瘤形成的影响

目的探究干扰长链非编码RNA MALAT1对血管瘤EOMA细胞的生长、运动及小鼠体内肿瘤形成的影响.方法体外培养血管瘤EOMA细胞,并分为空白对照组、阴性对照组、目的基因组,利用干扰RNA敲除MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达,使用RT-PCR方法检测MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达;使用Edu染色检测缺失RNA MALAT1后对细胞生长的影响,使用流式法检测血管瘤EOMA细胞凋亡情况,使用transwell检测血管瘤EOMA细胞侵袭情况;Western印迹检测血管瘤EOMA细胞中Ki67、PC-NA、caspase-3、caspase-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达情况;小鼠皮下注射EOMA细胞建立移植瘤模型,使用RT-PCR检测长链RNA的表达,检测shRNA敲除Lnc对肿瘤重量的影响,统计分析小鼠生存期,使用免疫组化检测Ki67和N-cadherin的表达情况.结果与空白对照组比较,阴性对照组MALAT1、Ki67、PCNA、caspase-3、caspase-9、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达、细胞生长、运动情况均无显著差异(P>0.05),与阴性对照组比较,目的基因组大鼠血管瘤EOMA细胞中MALAT1表达、EOMA细胞侵袭百分比、Ki67、PCNA和N-cadherin蛋白表达水平显著降低;EOMA细胞凋亡百分比、caspase-3、caspase-9和E-cad-herin蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);小鼠体内实验发现,与阴性对照组比较,目的基因组小鼠体内肿瘤质量、Ki67和N-cadherin阳性表达率显著降低,小鼠miR-377-5p表达水平、生存期显著增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论干扰长链非编码RNA MALAT1可以有效地抑制血管瘤EOMA细胞的生长、运动,促进其凋亡.

普萘洛尔对小鼠血管瘤细胞体外增殖及凋亡的影响

目的:通过β受体阻滞剂普萘洛尔作用于小鼠EOMA血管瘤细胞体外增殖及凋亡的实验研究,初步探讨普萘洛尔治疗血管瘤的机制。方法:体外培养EOMA细胞,使用不同浓度普萘洛尔分别作用于EOMA细胞24、36、48 h,应用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率、吖啶橙染色检测细胞凋亡情况,观察普萘洛尔对EOMA细胞体外增殖和凋亡的影响。结果:作用24 h后,随剂量增加,EOMA细胞存活率逐渐下降,与对照组相比,至药物浓度为75μmol/L时有显著差异(P<0.05),继续增加至800μmol/L时,细胞存活率接近0,同时吖啶橙染色示凋亡细胞逐渐增多,与对照组相比,至药物浓度75μmol/L时,细胞凋亡率有显著差异(P<0.05)。36 h组和48 h组变化趋势与24h组相似。结论:普萘洛尔在体外可有效抑制小鼠EOMA血管瘤细胞的增殖并促进其凋亡,这一作用呈现明显的剂量-时间效应依赖性。

过表达miR-338-3p对炎症信号通路的影响

目的研究过表达miR-338-3p在内皮细胞系EOMA中对炎症信号通路的影响。方法将EOMA细胞分为四组即对照组、miR-338-3p过表达组、TNF-α处理组、miR-338-3p与TNF-α共处理组。用Real time PCR检测miR-338-3p及黏附分子VCAM-1和ICAM-1mRNA表达水平,Western blot分析ERK/p38 MAPK信号通路活性。结果与对照组比较,miR-338-3p过表达组的黏附分子VCAM-1及ICAM-1mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显降低,而TNF-α处理组的黏附分子VCAM-1及ICAM-1mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显升高;miR-338-3p与TNF-α共处理组与TNF-α处理组比较,黏附分子VCAM-1及ICAM-1mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显降低;miR-338-3p与TNF-α共处理组与miR-338-3p过表达组比较,黏附分子表达水平及ERK/p38信号通路活性不再升高。结论过表达miR-338-3p抑制ERK/p38信号通路活性,降低黏附分子VCAM-1和ICAM-1mRNA表达水平;过表达miR-338-3p能够逆转TNF-α对ERK/p38通路的激活和TNF-α对黏附分子VCAM-1及ICAM-1mRNA表达的促进作用。

shRNA干扰技术沉默VEGF表达治疗血管内皮瘤的实验研究

目的构建血管内皮生长因子(VEGF)短发夹RNA真核表达质粒(shVEGF),观察其对血管内皮瘤细胞系(EOMA)细胞体外增殖及动物实验的影响。方法构建真核表达质粒pGenesil-3-shVEGF并转染EOMA细胞,采用CCK-8法检测shVEGF对EOMA细胞增殖能力的影响。建立EOMA细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为对照组和shVEGF组,肿瘤出现后,隔日测量瘤体体积,并观察体积变化。结果转染48h后EOMA细胞增殖受到抑制。体内实验显示经shVEGF治疗后,裸鼠皮下移植瘤体生长缓慢,体积明显缩小。结论RNA干扰技术实现VEGF基因沉默,能明显抑制EOMA细胞增殖及体内肿瘤生长,提示shVEGF在血管内皮瘤、血管瘤等血管瘤样病变的生物治疗中可能有较好的应用前景。

持续性植物状态(PVS)的中医证治

PVS是一种特殊类型的神昏,特征是睁眼若视,貌似清醒,静卧不动,不识人事,中医无此病名,应命名为"神呆"。其病因病机为先天不足,邪热犯脑,情志失调,颅脑损伤,毒邪入中,髓海不足;病位在脑,病性本虚标实,因实致虚,以虚为主;其气血亏虚,痰瘀阻窍,神明闭阻贯穿始终。病理关键是虚、瘀、痰三端。因此,宜益气养血、化痰祛瘀、开窍醒神,药宜温而动;自拟益神启窍方,方用黄芪、当归、麝香、桃仁、石菖蒲、白芷。

三种阳离子转染试剂对小鼠血管瘤内皮细胞转染效率及细胞毒性的影响

目的从三种常用的阳离子转染试剂中筛选出对小鼠血管瘤内皮细胞(EOMA)有较高转染效率和较低细胞毒性的转染试剂。方法以含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1为报告基因,以阳离子脂质体LipofectamineTM2000、LipofectamineTM PLUS和阳离子聚合物JetPEITM为转染试剂,按照转染试剂盒的说明优化其转染条件,分别转染EOMA细胞,24h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下对EOMA的细胞毒性。结果经优化转染条件,LipofectamineTMPLUS和JetPEITM转染的细胞中阳性细胞的最高比例分别为45%和47%,LipofectamineTM2000转染的细胞中荧光蛋白表达的比例最高(>80%),Lipofecta-mineTM2000试剂在最高转染效率的剂量下仍然保证了80%的细胞存活率。结论阳离子脂质体LipofectamineTM2000对小鼠EOMA细胞有较高的转染效率和较低的细胞毒作用。

内皮抑素在妇科肿瘤的研究进展

内皮抑素(endostatin)是在对小鼠血管内皮瘤(EOMA)细胞系的研究中发现的一种分子质量为20ku的蛋白,实验证明其对内皮细胞增殖有明显抑制作用,并通过抑制肿瘤相关的新生血管生成阻断肿瘤的血液供应,发挥抑制肿瘤生长作用,反复用药无任何毒副作用及耐药性。内皮抑素在妇科肿瘤中也有不同程度的表达,可作为妇科肿瘤早期诊断和治疗的新途径。

NF-κB p65 siRNA对延迟性排斥反应的抑制作用

目的探讨核因子kappa B(NF-κB)p65的小干扰RNA(siRNA)对延迟性排斥反应的抑制作用。方法血管内皮细胞(EOMA)分为7组:A组(空白对照),B组(阴性对照),C组(TNF-α处理),D组(siRNA处理),E组(scramble siRNA处理),F组(TNF-α+siRNA处理),G组(TNF-α+scramble siRNA处理)。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65siRNA转染入相应的EOMA细胞,24h后在C组、F组和G组中加入TNF-α(终浓度为20ng/ml)。于TNF-α加入后的6h提取各组细胞总RNA,RT-PCR法测定EOMA细胞内E选择素(E-selectin)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、白细胞介素1α(IL-1α)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)水平。结果 F组EOMA细胞内E-selectin、ICAM-1、IL-1α和VCAM-1表达明显高于A组,的明显低于C组和G组(P<0.01)。结论特异性siRNA抑制NF-κB p65表达可以有效抑制延迟性排斥反应。