大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１，回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因，再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％，而且无天然ＳＴ１生物毒性。

表面增强拉曼散射技术鉴别大肠杆菌和志贺氏菌的研究

以整个大肠杆菌和志贺氏菌为研究对象,通过和纳米银颗粒混合制片,利用表面增强拉曼效应检测并区分大肠杆菌和志贺氏菌.结果表明,未与纳米银颗粒混合的大肠杆菌和志贺氏菌没有明显的拉曼信号,而与纳米银颗粒混合后有明显的拉曼信号,二者有明显的区别,且重现性良好,可为鉴别大肠杆菌和志贺氏菌病原体研究及实际应用提供依据.

转聚磷激酶基因的大肠杆菌去除水体中的磷

为探索有效的生物除磷方法,构建了聚磷激酶基因(ppk)的表达载体pET28a(+),并转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,获得了可过表达ppk基因的工程菌BL-PPK.RT-PCR结果表明,ppk基因在转化的大肠杆菌中得到了高效表达.聚磷试验结果表明,培养10h后,转化了ppk基因的大肠杆菌细胞内聚磷含量比对照菌株高20倍,而培养液中可溶性磷浓度为对照菌株的约1/9.

抗人轮状病毒和大肠杆菌免疫乳持续性的研究

以引起婴儿腹泻的轮状病毒（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ａ．ｖ．）和大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｅ．ｃｏｌｉ）给妊娠后期的奶牛免疫，使之产生抗这两种病原的抗体，定期采乳，分别用试管凝集反应和反向间接血凝抑制试验检测大肠杆菌和轮状病毒抗体，并摸索其消长规律。试验结果表明：乳中轮状病毒和大肠杆菌高免抗体可持续近两个月，强化免疫，又可得到高免抗体，并能持续近一个月。

碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌中bla_(NDM)基因型检测及流行病学分析

目的检测上海交通大学附属瑞金医院临床分离碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌产NDM型碳青霉烯酶的情况,研究其流行病学特征。方法收集该医院2013年11月-2015年1月临床分离的18株对亚胺培南或美罗培南药敏纸片抑菌圈直径≤19 mm的大肠埃希菌。采用聚合酶链反应(PCR)检测bla_(NDM)型碳青霉烯酶基因并对阳性产物进行测序以确定基因型别;通过质粒转移接合试验了解耐药基因是否可以通过质粒进行水平传播;应用多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对产NDM酶的大肠埃希菌进行同源性分析。结果 18株耐碳青霉烯类大肠埃希菌中6株扩增到bla_(NDM)基因,其中4株为bla_(NDM-1),2株为bla_(NDM-5)。6株产NDM酶的大肠埃希菌中3株成功进行转移接合试验,MLST发现6株产酶菌株共分为5个ST型(ST5018,ST354,ST405,ST2967,ST156),与PFGE结果中5种不同的DNA谱型(A^E)相对应,其中2株菌株同为ST5018型且为PFGE-DNA谱型中A型的不同亚型(A1,A2)。结论本研究检出产NDM酶碳青霉烯类耐药大肠埃希菌。bla_(NDM)阳性病例多为散发,但由质粒介导的水平传播在bla_(NDM)的播散中可能起重要作用。上海地区首次检出NDM-5型碳青霉烯酶,应引起重视。

MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建

肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法。本研究借鉴前期经验,通过HepC基因的密码子优化,并与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合,构建了MBP-coHepC(基因密码子优化后的蛋白为coHepC)的大肠杆菌表达体系,结合培养条件优化大幅度提高了HepC的可溶表达比例,其摇瓶发酵总酶活值达到7603.46 IU·L?1;同时,本研究从转录和翻译水平揭示了HepC表达效果提高的可能原因。这些研究为肝素酶III的应用发展提供了基础。

禽多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌科间原生质体融合的研究

以耐药标记的华农系禽多杀性巴氏杆菌５：Ａ弱毒菌株（Ｃｈｌｒ，Ｎｏｒｓ）与禽大肠杆菌Ｏ２弱毒菌株（Ｎｏｒｒ，Ｃｈｌｓ）作亲本，在ＤＮａｓｅ１始终存在的条件下，采用溶菌酶ＥＤＴＡ法制备两亲本菌株原生质体后再生，原生质体形成率均９０％以上，原生质体再生率为３５６３％、５０９３％。通过聚乙二醇钙离子促融合剂系统，进行原生质体融合，成功地获得３株具有双亲本耐药性（Ｃｈｌｒ，Ｎｏｒｒ）和双菌体血清型（５：Ａ，Ｏ２）的融合菌株。它们的生化反应、菌体和菌落大小介于两亲本菌株之间，在肉汤培养中表现出双亲菌株的生长特性。经多次传代，表明３个融合株的上述性状是稳定遗传的。

天津地区大肠埃希菌临床株质粒介导的喹诺酮类耐药机制的研究

目的了解天津地区临床分离的大肠埃希菌中qnr、aac(6')-Ib-cr及qepA基因的流行情况,分析阳性菌株感染的微生物学及临床特征。方法从天津某三甲医院收集环丙沙星耐药(CPLX,MIC≥4μg/mL)的大肠埃希菌共75株,采用PCR法检测qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-Ib及qepA基因,对aac(6')-Ib基因阳性菌株用FokⅠ酶切确认aac(6')-Ib-cr基因,接合试验验证qnr的转移性。所有阳性菌株用PCR法检测β-内酰胺酶基因,并收集阳性菌株感染患者临床资料进行分析。结果 75株环丙沙星耐药的大肠埃希菌中共有18株(24%)携带qnr基因和(或)aac(6')-Ib-cr基因,其中qnrB、qnrS和aac(6')-Ib-cr检出率分别为5.3%,4%和21.3%,未检出qnrA和qepA。5株qnr阳性菌株均接合传递成功。18株qnr/aac(6')-Ib-cr阳性的大肠埃希菌中均检测出β-内酰胺酶基因。阳性菌株对喹诺酮类和头孢菌素类药物高度耐药且主要来源于泌尿系感染,感染患者均为中老年人。结论天津地区临床存在qnr和aac(6')-Ib-cr阳性菌株的流行,这是首次在天津发现qnr介导的喹诺酮类耐药。

乳糖促进大肠杆菌增殖的研究

在普通肉汤和普通琼脂培养基中加入一定量的乳糖，可明显地促进大肠杆菌（Ｅｃｏｌｉ）增殖。用平板计数法，麦氏比浊法及离心称重法，对６株禽源Ｅｃｏｌｉ和２株猪源Ｅｃｏｌｉ培养产物的含菌量、菌泥湿重测定，结果表明：在普通肉汤中加乳糖可使Ｅｃｏｌｉ产量增加约１００％；在普通琼脂中，加乳糖可使Ｅｃｏｌｉ产量增加２００％以上。

用原核翻译增强子提高人成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达

目的 用原核翻译增强子提高人成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达。方法 将原核翻译增强子序列插入到质粒pRIT 2T启动子的下游 ,再与成骨生长肽融合蛋白基因重组。热诱导表达融合蛋白 ,经亲和层析、FactorXa酶切、凝胶过滤层析得到纯化的成骨生长肽。结果 提高了成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达水平 ,使成骨生长肽融合蛋白的表达量超过了大肠杆菌蛋白总量的 5 0 %。结论 原核翻译增强子可提高外源基因在大肠杆菌中的表达。插入了原核翻译增强子的pRIT 2T质粒可作为高效表达融合蛋白的通用质粒载体。

PCR检测志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H基因

目的 建立一种志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的PCR诊断方法。方法 根据志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因序列 ,设计一对引物 ,优化各种工作条件 ,建立一种PCR诊断方法。结果 本法特异性好 ,敏感性可达 10CFU ,整个实验过程在 6～ 7h内完成。结论 建立的方法在理论和实际应用上都有优越性 。

大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究

[目的]提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。[方法]根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法。[结果]利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.3～0.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100～300倍。[结论]该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。

药品微生物限度检查中大肠杆菌检查特例

目的:对疑似大肠杆菌的菌株进行检测。方法:MUGIndole法和药典法。结果:MUGIndole法简便、快速、准确,优于药典法。结论:检查大肠菌群比检查大肠杆菌更能说明药品中污染控制菌的情况。

曲酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用研究

为了探讨曲酸对食品中常见污染细菌的抑制效果,采用平板稀释涂布法和圆滤纸片法研究曲酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)、曲酸抑菌热稳定性以及曲酸与ε-聚赖氨酸复合抑菌效果。实验表明:曲酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌MIC分别是0.25%、0.40%;曲酸经过80、100、120℃处理30 min后MIC不变;1.0%的曲酸与0.001%的ε-聚赖氨酸复合后对金黄色葡萄球菌抑菌能力增强。结论:曲酸对食品中常见污染细菌具有良好的抑菌效果而且热稳定性好,与ε-聚赖氨酸复合对金黄色葡萄球菌抑菌效果具有协同增效作用。

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建

背景:KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的:构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法:聚合酶链反应扩增(PCR)目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH-KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT-PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论:重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。

大肠杆菌耐药机制的研究进展

对大肠杆菌耐药的现状、特点、生化机制和分子机理及抑制剂方面的研究进行了综述,以便正确理解大肠杆菌耐药性的特点及其规律,从而为防治大肠杆菌耐药性的产生及合理用药提供理论依据.

用TEM和SEM对肠毒性大肠杆菌超微结构及其定居状态的观察

产肠毒性大肠杆菌以其密集的纤毛实现了它与宿主小肠上皮细胞微绒毛的牢固粘附。用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)可把这种状态清晰地显现出来。该菌菌体长约200nm,菌壁厚约10nm,为周身性纤毛。纤毛的长短以及菌体定居状态因菌株的不同而有所差异。

仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

由湛江市3个养猪场采集到40份仔猪黄痢、白痢腹泻粪便样品,共分离到40株大肠杆菌,其中7株是致病性大肠杆菌,三个猪场致病性大肠杆菌的分离率分别为15.4%、10%和43%。对7株致病性大肠杆菌进行药物敏感性试验,结果表明:它们均对恩诺沙星、菌必治和丁胺卡那霉素敏感,而对复方新诺明、阿莫西林、氨苄青霉素、四环素和庆大霉素的耐药率为100%,对氯霉素、头孢氨苄和痢特灵的耐药率为85.7%,对卡那霉素和链霉素的耐药率为57.1,%对氟哌酸和环丙沙星的耐药率为14.3%。猪场选用较敏感药物来防治仔猪大肠杆菌病,使疫病得到了有效控制。

外加碳源对抗生素诱导大肠杆菌Hormesis效应的调控作用

抗生素对细菌通常表现出“低促高抑”的Hormesis效应,这显著影响了抗生素的生态风险评估。目前关于抗生素诱导细菌Hormesis效应的研究多集中于单一碳源条件,针对多种碳源共存条件的相关研究还十分有限。因此,为进一步探究外加碳源对抗生素诱导细菌Hormesis效应的影响,本文以大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)为受试生物,在外加不同浓度葡萄糖的Mueller-Hinton培养基中测定了盐酸四环素(tetracycline hydrochloride,TCH)和2(5H)-呋喃酮(2(5H)-furanone, 2F)2种抗生素单一及联合暴露对E.coli生长的毒性效应,并分析了外加葡萄糖与抗生素对E.coli生长的交互效应。结果表明,TCH和2F单一及联合暴露均能诱导E.coli产生Hormesis效应,随着外加葡萄糖浓度的升高,TCH、2F和TCH+2F在低浓度下对E.coli生长的促进作用逐渐增强,最大促进率分别由47.66%、9.08%、5.63%增加到158.65%、40.20%、21.30%;在高浓度下对E.coli生长的抑制作用逐渐减弱,EC_(50)值分别从3.17E-05、1.62E-02、3.71E-03 mol·L^(-1)增加到9.24E-05、4.10E-02、1.01E-02 mol·L^(-1);外加葡萄糖与抗生素对抑制E.coli生长的交互效应总体上呈拮抗作用,且随着外加葡萄糖浓度升高拮抗作用也随之增强,可以看出外加碳源能够降低抗生素的细菌毒性。本研究可为从外界营养条件角度更加全面评估抗生素的Hormesis效应及生态风险提供参考和数据支持。

肠出血性大肠埃希菌EIS基因的克隆与植物表达载体的构建

为给利用转基因植物生产出血性大肠杆菌疫苗的研究奠定基础,应用PCR扩增技术从原核表达载体pET-28a(+)-EIS上克隆对出血性大肠杆菌具有保护性免疫的EIS基因序列,并采用T-A克隆方法克隆到pUC18上,通过酶切、连接、转化等技术构建植物表达载体,经酶切、测序验证后将构建植物表达载体导入农杆菌中。结果:扩增到约为1 800bp的EIS基因,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1300-EIS,并导入到农杆菌EHA105中。