纤维肌痛综合征生物标记物的筛选及免疫细胞浸润分析

背景:纤维肌痛综合征作为常见风湿病,其发病与中枢敏化及免疫异常有关,但具体过程尚未阐明,缺乏特异性诊断标志物,不断探索该病的发病机制具有重要的临床意义。目的:基于加权基因共表达网络分析(WGCNA)等生物信息学方法和机器学习算法筛选纤维肌痛综合征潜在的诊断相关标志基因,并分析其免疫细胞浸润特征。方法:对来自基因表达综合数据库(GEO)的纤维肌痛综合征数据集转录谱进行差异分析和WGCNA分析,整合筛选出差异共表达基因,进一步采用机器学习套索回归(LASSO)算法、支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)机器学习算法来识别核心生物标志物,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线以评估诊断价值。最后,采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)和基因集富集分析(GSEA)评估纤维肌痛综合征的免疫细胞浸润情况及通路富集。结果与结论:①对GSE67311数据集按照log2|(FC)|>0,P<0.05的条件进行差异分析后获得8个下调的差异表达基因;进行WGCNA分析后获得正相关性最高(r=0.22,P=0.04)的模块(MEdarkviolet)内含基因497个,负相关性最高(r=-0.41,P=6×10-5)的模块(MEsalmon2)内含基因19个;将差异表达基因与WGCNA的2个高相关性模块基因取交集,获得7个基因。②对上述7个基因进行LASSO回归算法筛选出4个基因,进行SVM-RFE机器学习算法筛选出5个基因,两者取交集后确定了3个核心基因,分别为重组1号染色体开放阅读框150蛋白(germinal center associated signaling and motility like,GCSAML)、整合素β8(Integrin beta-8,ITGB8)和羧肽酶A3(carboxypeptidase A3,CPA3);绘制3个核心基因的ROC曲线下面积分别为0.744,0.739,0.734,提示均具有很好的诊断价值,可作为纤维肌痛综合征的生物标志物。③免疫浸润分析结果显示,与对照组相比纤维肌痛综合征患者记忆B细胞、CD56 bright NK细胞和肥大细胞显著下调(P<0.05),且与上述3个生物标志物显著正相关(P<0.05)。④富集分析结果提示,纤维肌痛综合征的富集途径包括9条,主要与嗅觉传导、神经活性配体-受体相互作用及感染等通路密切相关。⑤上述结果显示,纤维肌痛综合征的发生发展与多基因参与、免疫调节异常及多个通路失调有关,但这些基因与免疫细胞之间的相互作用,以及它们与各通路之间的关系尚需进一步研究。

植物防龋疫苗融合基因表达载体中选择标记基因的去除

背景:出于对转基因植物的食用安全和生态安全的考虑,标记基因的存留是影响转基因植物的首要安全问题。目的:基于免疫防龋原理,课题组针对表面蛋白和葡糖基转移酶这2种致龋毒力因子,构建植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8,为转基因植物疫苗的研发提供基础。方法:该研究运用DNA重组技术,通过DNA片段分离、连接、转化、克隆子检测、测序等系列步骤,将植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8中的选择性标记基因Km和GUS去除。结果与结论:标记基因去除效率达99%,该研究为免疫防龋的转基因植物疫苗的安全生产奠定了良好的实验基础,也为其它植物疫苗的载体构建提供思路。

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究 Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。

鸭IFN-α真核表达质粒基因枪免疫对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭细胞免疫调节作用初探

为探索鸭α干扰素(IFN-α)真核表达质粒(pcDNA-SDIFN-α)对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭的细胞免疫调节作用,本研究将pcDNA-SDIFN-α以1、3和6μg/只3个剂量用基因枪轰击法分别免疫28日龄鸭,以PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,所有鸭15 d后接种鸭瘟(DP)弱毒疫苗。接种后第3、7、14、21、28、35、49、63、84天采血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鸭外周血中T淋巴细胞转化效果;第7、14、21、28、35、49天采血用流式细胞仪(FACS)测定CD3+T淋巴细胞数量的动态变化。结果发现:①T淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值),不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭外周血T淋巴细胞转化功能于第3-84天均高于PBS和空载体pcDNA对照组,其中第3-84天1μg/只组极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组;1μg/只组第3-35天显著(P≤0.05)高于3、6μg/只组;3μg/只组于第14-35天高于6μg/只组,但差异不显著(P≥0.05);pcDNA对照组略高于PBS对照组,但差异不显著(P≥0.05);②CD3+T淋巴细胞数量变化,不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭于第7-49天均高于PBS和pcDNA对照组,其中1μg/只组于第14-49天极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组于第21-49天极显著(P≤0.01)高于PBS对照组和显著(P≤0.05)高于pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组;1、3和6μg/只组之间差异不显著(P≥0.05);pcDNA组于第14-49天高于PBS组,但差异不显著(P≥0.05)。研究表明,pcDNA-SDIFN-α提前15 d免疫能显著增强DP弱毒疫苗诱导的鸭细胞免疫力,以基因枪免疫1μg/只的效果最佳,它是一种良好的增强DP弱毒疫苗细胞免疫的分子佐剂。

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。

2拷贝SLT-ⅡvB在猪霍乱沙门氏菌C500crp^-/asd^-缺失株中的表达及小鼠免疫试验

为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗,从pMDSLT-Ⅱ中扩增去信号肽后的SLT-ⅡvB基因,将2拷贝SLT-ⅡvB与pYA3493连接。阳性质粒pYA2B电转化C500crp-/asd-缺失株,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting,重组菌C500crp-/asd-(pYA2B)口服免疫小鼠,腹腔攻10 LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒C78-1和2 LD50的猪水肿大肠杆菌强毒ED3株,计算攻毒保护率。结果显示,2 SLT-ⅡvB在C500crp-/asd-缺失株中获得了表达。C500crp-/asd-(pYA2B)免疫组对ED3的攻击能提供60%保护,而对照组不能提供任何保护。2组对C78-1攻击均提供100%保护,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病二联疫苗及进一步提高免疫效果提供依据。

人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用

目的 克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA ,并构建其真核表达载体 ,探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性。方法 从KG 1a细胞提取总RNA ,RT PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定 ,构建其真核表达载体pcD NA3 1 CD34。选取 4～ 6周龄的BALB/c小鼠 12只 ,随机分为 3组 ,预先在股四头肌注射 2 5 %的蔗糖溶液 5 0 μl,然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3 1以及PBS稀释的pcDNA3 1 CD34,每 2周 1次共 3次。免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况。结果 所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长 886bp ,扩增片段大小与理论值相符 ,测序结果与文献报道完全一致 ,并且在 5′端引入HindⅢ酶切位点 ,3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA。随后将其定向插入真核表达载体 pCD NA3 1中 ,称之为pcDNA3 1 CD34,经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实 pcDNA3 1 CD34真核表达载体构建成功。FACS检测结果表明 ,用pcDNA3 1 CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅 1/ 4只在免疫结束后的第 2～ 6周有较低滴度的CD34抗体产生 ,其余 3只血清中均未检测到CD34抗体。结论 成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体 pcDNA3 1 CD34。

甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达。提取流感病毒Influenza A/FM/1/47(H1N1)RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到Vero细胞,免疫荧光技术鉴定其表达。甲型流感病毒M1蛋白重组质粒pcDNA3.1-M1的成功构建,为开发研制流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定了基础。

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增 ,克隆构建真核表达质粒pcDNA3 /HSV ⅡTK/As。方法 从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV Ⅱ )Sav株感染的Hep 2细胞上清液中提取HSV 2基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法扩增胸苷激酶 (TK )基因 ,将扩增的片段克隆入载体 pcDNA3 中 ,挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切 pcDNA3 /HSV ⅡTK ,得到目的基因TK ,将其克隆于已构建的真核表达载体 pcDNA3 /As上。结果 HSV Ⅱ TK基因全部编码区为 112 8bp ,基因序列与 genebank中报道相符。新质粒 pcDNA3 /HSV ⅡTK/As经限制性核酸内切酶 (BamHⅠ ,HindⅢ )酶切后得到 70 0bp(As)及 10 0 0bp(HSV ⅡTK)相应基因片段。 结论 本研究成功构建 pcDNA3 /HSV ⅡTK /As真核表达质粒。

鹅副黏病毒HN基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果

以大量提取的鹅副黏病毒(GPMV)HN基因真核表达载体pVAXⅠ-HN和空载体pVAXⅠ肌肉注射BALB/c小鼠。利用MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,用ELISA方法检测小鼠血清中GPMV抗体,观察GPMV HN基因真核表达载体pVAXⅠ-HN在小鼠中的免疫效果。结果表明:试验组小鼠血清中GPMV特异性抗体水平显著高于对照组,ELISA试验结果OD492值分别为1.360 0±0.101 7和0.358 0±0.018 1;试验组与对照组的淋巴细胞增殖试验刺激指数(SI)差异不显著,其SI值分别为1.181 2±0.030 1和1.119 1±0.035 5。由此说明,GPMV HN基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫。

大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunitA，LTA）基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统，探讨重组LTKA63（rLTKA63）粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因，利用定位突变技术构建LTKA63突变体，T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b。构建LTKA63原核表达系统，通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较，所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．03％～99．61％和98．33％～99．22％。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15％左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21．9％和36．2％。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统，所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。

腺病毒介导突变Rip2基因对膀胱上皮细胞清除克雷伯杆菌的影响

目的探讨受体相互作用蛋白2(Rip2)在克雷伯杆菌所致的尿路感染中的作用。方法使用含有突变Rip2基因(mRip2)、绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒(Ad-mRip2-GFP)感染人膀胱上皮癌细胞T24细胞,表达GFP为转染成功标志,观察转染率,同时感染含有GFP基因腺病毒做对照,利用克雷伯杆菌临床分离株Kp5与细胞37℃孵育4、24、48小时,用平板培养菌落计数活菌数。结果刺激后,在感染Ad-mRip2-GFP的T24细胞清除胞内Kp5能力下降,与Ad-GFP组比较P<0.01。结论Rip2可以阻断膀胱上皮细胞的清除克雷伯杆菌作用,提示Rip2在膀胱上皮细胞的天然免疫中可能起重要作用。

真核化的原核表达系统增强HBV preS2/S基因免疫的效果

目的研究真核化的原核表达系统——pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒共表达体系与常规真核表达质粒相比在真核细胞中的表达差异;基因免疫小鼠诱生特异性体液免疫应答的能力及二者所诱生的抗体亚型的差异。方法运用分子生物学方法构建真核化的原核表达系统,将构建的质粒进行基因免疫,应用DOT-EIA和ELISA等检测其所产生的抗体水平。结果①真核化的原核表达系统在真核细胞中的表达能力明显强于常规真核表达质粒。②真核化的原核表达系统基因免疫小鼠不仅可诱生特异性体液免疫应答,且具有明显增强效应(P<0·05)。③真核化的原核表达系统与常规真核表达质粒相比不仅可诱生同等程度的Th1型免疫应答,而且能够诱生更强的Th2型免疫应答(P<0·01)。结论真核化的原核表达系统——pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒能诱导较强的体液免疫应答。

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因(约2000bp)。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1(+)载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1(+)表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达情况。方法:对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切(XhoI和BamHI)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果:测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论:成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。

大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体 LTKA63及B亚单位(heat-labile entemtoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力。建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带。LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体。rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％左右。LTKA63作用后T_H1 和T_H2细胞较阴性对照组分别增加19．9％和42．3％,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合。 33．3％(4／12)rUreB和41．7％(5／12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性。rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16．7％～25．0％(P>0．05),rUreB和rHpaA特异性S-Iga阳性率可达41．6％- 58．3％(P<0．01)。结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性。