基于网络药理学探究地锦草防治溃疡性结肠炎的作用机制

【目的】基于网络药理学并结合分子对接方法分析地锦草防治溃疡性结肠炎(UC)的活性成分和靶点,探究其潜在机制,进而保护动物肠道。【方法】利用TCMSP数据库获取地锦草的活性成分及对应药物靶点。通过GeneCards、DisGeNET、TTD、PharmGKB和DrugBank数据库获取疾病靶点。药物靶点和疾病靶点取交集获取潜在靶点,分别借助STRING和DAVID数据库对潜在靶点进行蛋白互作(PPI)分析及GO功能和KEGG通路富集分析。借助AutoDock 1.5.7软件进行分子对接验证,利用PyMOL软件将对接结果可视化。通过体内试验利用30只BALB/c小鼠制作葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的UC模型,设置对照组、模型组、地锦草低(5 mg/mL)、高(15 mg/mL)剂量组、美沙拉嗪组(52 mg/mL)。除对照组外,其余各组小鼠连续7 d自由饮用3%DSS诱导UC模型,各给药组小鼠每天灌胃1次,根据小鼠体重灌胃相应剂量的药物0.1 mL/10 g,对照组和模型组小鼠灌胃等体积无菌生理盐水,连续7 d,测其体重变化、疾病活动指数(DAI)评分和结肠长度,检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL6)和IL10含量。【结果】地锦草主要活性成分有山柰酚、4’-5二羟基黄酮和鞣花酸等,对应的药物靶点256个,疾病靶点4265个,潜在靶点128个,核心靶点7个。GO功能富集涉及对活性氧的反应、对氧化应激的反应、炎症反应、膜筏、小窝、激酶调节剂活性等。KEGG信号通路涉及PI3K-Akt和TNF信号通路等。分子对接结果显示,山柰酚和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、4’,5-二羟基黄酮和PPARG、鞣花酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、鞣花酸和IL6具有较强结合潜力。体内试验结果表明,与对照组相比,模型组小鼠体重严重下降,严重的甚至出现水样血便,DAI评分极显著升高(P<0.01),结肠组织的黏膜层及黏膜下层出现大量炎性细胞浸润,甚至有小溃疡的出现,表明小鼠UC造模成功。与模型组相比,各给药组小鼠结肠组织黏膜层炎症细胞浸润减少,DAI评分极显著降低(P<0.01),结肠挛缩情况好转,TNF-α和IL6含量显著减少(P<0.05),IL10含量显著增加(P<0.05),抑制炎症发生。【结论】地锦草中的山柰酚、4’-5二羟基黄酮和鞣花酸等主要活性成分可能通过作用于AKT1、PPARG和IL6等核心靶点参与炎症相关信号通路及生物功能,抑制炎症,减轻肠道损伤,从而发挥防治UC的效用。

地锦草总黄酮对罗斯308肉鸡生长性能、免疫功能、抗氧化能力及盲肠菌群的影响

试验旨在研究地锦草总黄酮对罗斯308肉鸡生长性能、免疫功能、抗氧化能力及盲肠菌群的影响。选取240只1日龄雄性罗斯308肉鸡随机分为3组,每组4个重复,每个重复20只鸡,试验期42 d。对照组饲喂基础日粮,地锦草总黄酮组饲喂基础日粮+300 mg/kg地锦草总黄酮,土霉素组饲喂基础日粮+200 mg/kg土霉素。结果显示:与对照组相比,地锦草总黄酮组1~21日龄和1~42日龄平均日增重显著升高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05),与土霉素组无显著差异(P>0.05);地锦草总黄酮组血清免疫球蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),免疫器官指数显著高于对照组和土霉素组(P<0.05);地锦草总黄酮组血清超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于对照组和土霉素组(P<0.05),丙二醛含量显著低于对照组和土霉素组(P<0.05);地锦草总黄酮组盲肠菌群多样性显著高于土霉素组(P<0.05);在科和属水平上,地锦草总黄酮组普雷沃氏菌科、p_251_o5菌科及其未培养菌属、螺旋体科及密螺旋体2属、纤维杆菌科及纤维杆菌属和WCHB1_41未培养菌科及未培养菌属等有益微生物的相对丰度显著高于对照组和土霉素组(P<0.05);莫拉菌科及不动杆菌属、动球菌科及土源芽孢杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属显著富集于土霉素组(P<0.05)。研究表明,罗斯308肉鸡日粮中添加300 mg/kg地锦草总黄酮能够替代土霉素,增强肉鸡生长性能、免疫功能和抗氧化能力,提高盲肠菌群的多样性及有益菌比例,从而在饲料替抗中具有一定应用潜力和良好开发前景。

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定地锦草中8种成分的含量

目的:建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)用于同时测定地锦草中2种有机酸类和6种黄酮类成分的含量。方法:采用Hypersil GOLD C18(150 mm×3.0 mm,3μm),流动相为0.3%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为40℃,进样量为2μL;质谱采用ESI源,负离子模式监测,喷雾电压为-3000 V,离子化温度为500℃,多反应监测模式(MRM)用于定量分析。结果:所测定地锦草中的8个成分在测定浓度范围内峰面积和浓度均呈良好的线性关系(r≥0.9910),加样回收率在96.1%~99.9%,精密度、重复性和稳定性良好并符合方法学考察要求。结论:该方法简便、快速、准确、可靠,可用于地锦草中8种成分的含量测定。

地锦草黄酮醇诱导U14宫颈癌小鼠肿瘤细胞凋亡作用及其机制

目的研究地锦草黄酮醇(Euphorbia Humifusa Willd Flavonol,EHWF)诱导U14宫颈癌小鼠肿瘤组织细胞凋亡作用和分子机制。方法将40只U14宫颈癌小鼠随机分成阴性对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组、EHWF低剂量组和EHWF高剂量组四组,每组各10只。接种肿瘤24小时后,小鼠灌胃给药,EHWF剂量分别为100 mg/kg和200 mg/kg,连续给药14天。阴性对照组灌服蒸馏水,阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(25 mg/kg)。第15天,取肿瘤组织。TUNEL染色检测细胞的凋亡情况;流式细胞仪分析小鼠肿瘤细胞周期与细胞凋亡关系;Western-blot分析Caspase-8、Caspase-3、CyclinD1和P16在凋亡过程中蛋白表达变化。结果TUNEL染色分析发现高剂量组肿瘤组织中凋亡细胞明显高于对照组。与对照组比较,细胞周期中的S期及G2/M期比例明显降低。凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-3和P16在高剂量组中表达明显增加,而周期蛋白CyclinD1表达下调。结论EHWF参与诱导U14宫颈癌小鼠肿瘤细胞凋亡过程。

苗药地锦草对糖尿病肾病大鼠肾小球足细胞相关蛋白表达的影响

目的观察苗药地锦草对糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)大鼠肾小球足细胞相关蛋白Nephrin、Desmin和Angptl4表达的影响,明确其在DKD治疗中的作用机制。方法30只8周龄雄性SD大鼠随机分为:正常对照组(Normal,N组),DKD组(D组),DKD地锦草治疗组(Euphorbia humifusa,E组)。D组与E组大鼠单次尾静脉注射链脲佐菌素(Streptozobocin,STZ)(55 mg/kg)复制DKD模型,N组注射溶媒柠檬酸缓冲液,连续3次24 h尿白蛋白量>5 mg/d可确定为糖尿病肾病成模,5周后D组10只大鼠及E组9只大鼠DKD成模。DKD模型复制成功后,E组大鼠灌胃法服用地锦草300 mg/(kg·d),D组与N组灌胃给予同体积普通双蒸水,各组大鼠灌胃共16周。所有大鼠在处死前称重、每周收集大鼠留尿检测24 h尿白蛋白、留血检测血清白蛋白、尿素氮、肌酐、胆固醇、白蛋白;苏木素-伊红(HE)染色、马松三色染色(Masson)观察肾病理学结构;透射电镜观察足细胞的形态;WT1染色定位足细胞并采用disector/fractionator方法行足细胞计数;免疫组化观察Nephrin、Desmin、Angptl4的蛋白定位;Western blot法检测Nephrin、Desmin、Angptl4、Collagen IV的蛋白表达量;qPCR法检测Nephrin、Desmin、Angptl4、Collagen IV的mRNA含量。结果D组较N组大鼠血糖、24 h尿白蛋白、尿素、肌酐、胆固醇均明显升高,白蛋白明显降低(P<0.05)。E组大鼠上述各指标均较D组明显改善(P<0.05)。HE及Masson染色可见,N组大鼠肾小球结构完成,系膜细胞及基质正常。D组大鼠肾小球系膜细胞增生,系膜区基质沉积较多。E组大鼠经地锦草灌胃治疗后上述情况得以改善。透射电镜显示N组大鼠肾小球足细胞足突正常,D组大鼠足突融合或消失,E组大鼠足突较完整。WT1染色显示D组足细胞计数较N组减少,E组较D组明显增加(P<0.05)。免疫组化,Western blot及qPCR结果显示,Desmin、Angptl4及Collagen IV蛋白及mRNA在N组表达较少,上述指标在D组表达明显增多(P<0.05),E组大鼠经地锦草治疗后Desmin、Angptl4及Collagen IV蛋白及mRNA的表达较D组明显减少(P<0.05)。D组Nephrin蛋白及mRNA表达较N组明显减少,E组较D组表达增多(P<0.05)。结论地锦草治疗可以明显减少DKD大鼠足细胞Desmin、Angptl4及Collagen IV的表达并增加Nephrin的表达,有效保护足细胞的机械屏障及电荷屏障,抑制足细胞发生转分化,减轻DKD大鼠的蛋白尿并改善其肾功能。

地锦草水提物在IPEC-J2细胞中的抗炎与抗氧化作用

【目的】为了揭示地锦草(EH)在猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中的抗炎和抗氧化作用。【方法】利用不同浓度EH水提物(0、5、10、50、125、200μg/mL)处理IPEC-J2细胞12 h,通过CCK-8法检测IPEC-J2细胞活力,确定EH处理细胞的最佳浓度。将IPEC-J2细胞随机分为对照组(CT)、脂多糖(LPS)组(LPS)、EH+LPS组(ELP),每组3个重复。CT组细胞正常培养不做任何处理,LPS组细胞用5μg/mL LPS处理,ELP组细胞用5μg/mL LPS和最佳浓度EH共处理,各组细胞均处理12 h后,收集细胞和上清。利用实时荧光定量PCR方法检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)mRNA表达;ELISA法检测上清液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,化学荧光法检测上清液中活性氧(ROS)水平。【结果】与0μg/mL EH组相比,5、50μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力显著增加(P<0.05);10μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力极显著增加(P<0.01),125μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力下降,但差异不显著(P>0.05),200μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力极显著下降(P<0.01)。因此,后续选用10μg/mL EH处理IPEC-J2细胞。与CT组相比,LPS组IPEC-J2细胞中IL-6、TNF-α基因mRNA的表达极显著增加(P<0.01),上清液中MDA含量和细胞ROS的荧光强度极显著增加(P<0.01),Keap 1、Nrf 2和HO-1基因mRNA表达极显著下降(P<0.01),抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量极显著下降(P<0.01)。与LPS组相比,ELP组IPEC-J2细胞中IL-6基因mRNA表达极显著下降(P<0.01),TNF-α基因mRNA的表达显著下降(P<0.05),细胞上清液中MDA含量和细胞ROS的荧光强度均极显著下降(P<0.01),Keap 1、Nrf 2、HO-1基因mRNA表达极显著增加(P<0.01),GSH-Px含量极显著升高(P<0.01),SOD含量显著升高(P<0.05)。【结论】EH水提物在猪小肠上皮细胞中通过激活Keap1/Nrf2信号,提高抗氧化酶SOD和GSH-Px含量,启动下游靶基因HO-1表达,发挥抗炎和抗氧化的作用,且10μg/mL EH水提物作用效果最佳。

GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS结合网络药理学探讨地锦草药效物质基础及其抗炎作用机制

目的采用色谱联用技术分析地锦草主要成分,并联合网络药理学预测其抗炎作用的潜在靶点和信号通路,阐明地锦草治疗炎症的作用机制。方法通过GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析地锦草的化学成分,借助中药系统药理数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)、地锦草相关文献筛选地锦草活性成分;采用SwissTargetPrediction数据库预测靶点,采用GeneCards、DrugBank、DisGeNET数据库获取地锦草相关治疗靶点,将成分靶点和疾病靶点取交集,获得交集靶点;凭借STRING 11.5数据库和Cytoscape 3.9.0软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并筛选核心靶点。采用DAVID 6.8进行GO注释和KEGG通路富集分析,构建“化合物-靶点-通路”网络。结果GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS分别鉴定出50、76种成分,筛选出地锦草抗炎的12个活性成分及214个成分靶点;根据数据库筛选得到10688个抗炎相关靶点、活性成分与疾病交集靶点198个;借助CytoNCA插件筛选出核心靶点37个;DAVID数据库富集分析显示,地锦草主要通过磷脂酰肌-3-激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B,PI3K/PKB)、酪氨酸激酶受体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、甲状腺激素、雌激素等信号通路发挥治疗炎症的作用。结论地锦草通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗炎症的作用,体现了中药复杂系统的作用特点,为全面阐释地锦草药效物质基础提供一定参考。

GC-MS/MS法检测肠炎宁片及其药材中禁用农药残留

目的建立同时定量分析肠炎宁片及其原料药材地锦草、金毛耳草中31个禁用农药残留的方法。方法用乙腈提取样品,再经改良后的Quick(快速)-Easy(容易)-Cheap(便宜)-Effective(有效)-Rugged(稳定)and Safe(可靠)(QuEChERS)方法进行净化,使用气相色谱-三重四极杆质谱仪(GC-MS/MS)检测,样品分析采用基质匹配标准曲线定量法。结果所建立的方法学考察均合格,平均回收率为72.0%~113.0%,相对标准偏差(RSD)为2.4%~17.8%。经过检测,并未检出《中国药典》2020年版通则0212项下规定的禁用农药。结论该方法精密度和重复性良好,能够快速、简便地完成禁用农药检测,可用于肠炎宁片的安全性监测。

地锦草乙醇提取物对草莓的贮藏保鲜作用

研究地锦草乙醇提取物对草莓的影响来证实其对草莓贮藏保鲜有作用。以蒸馏水为对照,用不同浓度的提取液对淮南红颜草莓进行浸泡处理,选取相关品质指标,比较保鲜效果。处理组草莓采后生理品质显著提高,贮藏时间延长。与对照组相比,质量浓度为6.0 mg/mL的处理组失重率降低11.9%,可溶性固形物含量增加2.5%,维生素C含量增加23.1%,腐败指数降低37.8%,DPPH、ABTS自由基清除率分别增加13.8%、6.6%。结果表明,6.0 mg/mL地锦草乙醇提取液浸泡处理对草莓贮藏保鲜有较好的效果。

地锦草化学成分的研究

目的 研究地锦草的化学成分。方法 采用硅胶柱层析分离和 Sephadex L H- 2 0纯化 ,从地锦草中分得 9个化合物 ,经理化性质和波谱分析鉴定了它们的结构。结果 它们分别为β-谷甾醇 ( ) ,没食子酸 ( ) ,鞣花酸( ) ,短叶苏木酚 ( ) ,槲皮素 ( ) ,山奈酚 ( ) ,芹菜素 - 7- O-葡萄糖苷 ( ) ,木犀草素 - 7- O-葡萄糖苷 ( ) ,槲皮素 - 3- O-阿拉伯糖苷 ( )。结论 化合物 , , , 和

蒙药地锦草总黄酮提取工艺研究

对蒙药地锦草总黄酮提取工艺进行了研究。结果表明：乙醇提取法优于水提取法；用６倍量的７５％乙醇浸泡１２ｈ后回流提取１．５ｈ，共提取３次为最佳方案；提取液经石油醚脱色正丁醇萃取即得精制总黄酮。

地锦草总黄酮抗氧化作用的研究

地锦草总黄酮呈剂量依赖性的抗Ｏ－２·和·ＯＨ－的氧化作用。在ＶＢ２－Ｍｅｔ－ＮＢＴ体系中对Ｏ－２的ＳＣ５０＝０．５８μｇ／ｍｌ，ＩＣ５０＝０．３５μｇ／ｍｌ；在Ｖｉｔ·Ｃ－Ｃｕ２＋－Ｃｙｔｏ·Ｃ体系中对·ＯＨ－的ＳＣ５０＝２．４μｇ／ｍｌ，ＩＣ５０＝２．１μｇ／ｍｌ；在Ｖｉｔ·Ｃ－Ｆｅ２＋－ＤＲ体系中对ＭＤＡ的ＳＣ５０＝１５１．８μｇ／ｍｌ。地锦草的消肿、清热，伤口愈合等药效作用的发挥。

厚朴体外抑菌作用研究

目的探讨厚朴的体外抑菌作用。方法用K-B纸片扩散法。100%厚朴浸出液滤纸片对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌抑菌作用进行研究。结果厚朴对以上细菌均有明显抑菌作用。结论厚朴在体外有明显的抑菌作用。

高效液相色谱法测定地锦草中槲皮素的含量

目的 :建立地锦草中槲皮素高效液相色谱测定方法。方法 :色谱柱Kromasil C18(4.6mm× 2 5 0mm ,5μm) ,流动相为乙腈 0 .4 %磷酸 (40∶6 0 ) ,检测波长 370nm ,流速 1.0mL·min-1。结果 :槲皮素在 0 .0 36 4～ 0 .12 74μg线性关系良好 (r =0 .9999) ,回收率 10 0 .7% ,RSD 2 .5 %。 结论 :为地锦草及其制剂提供了分析方法 ,该法简便 ,结果可靠。

RP-HPLC法同时测定地锦草片中3种黄酮苷元的含量

目的建立同时测定地锦草片中槲皮素、木犀草素和山柰酚含量的HPLC法。方法采用KromasilC18柱（250mm×4．6mm，5μm），以甲醇一体积分数为0．1％的磷酸溶液（体积比为52：48）为流动相，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为360nm，柱温30℃。结果槲皮素、木犀草素和山柰酚的线性范围分别为1．50-30．0mg·L^-1（r=0．9999）、2．24-44．8mg·L^-1（r=0．9998）和0．220-4．40mg·L^-1（r=0．9998）；平均加样回收率（n=9）分别为100．1％、100．5％和98．8％。结论方法简便、结果准确、重现性好，可用于地锦草片的质量控制。

地锦草总黄酮预防四氯化碳所致急性肝损伤的实验研究

目的研究地锦草总黄酮(total flavonoids ofEuphorbiae hum ifusae,TFEH)对四氯化碳造成的小鼠急性肝损伤的保护作用。方法四氯化碳造成小鼠急性肝损伤模型,测定血清谷丙转氨酶(serum glutam ic pyruvic transam inase,SGPT)、肝组织谷丙转氨酶(liver glutam ic pyruvic transam inase,GPT)、超氧化物歧化酶(superoxidase d ismutase,SOD)活性及丙二醛(m alonaldehyde,MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)含量,采用光镜观察肝脏组织学变化。结果与四氯化碳模型组比较,经TFEH预防性治疗后,GPT、LGPT活性和MDA含量均明显降低(P<0.05或P<0.01),而GSH含量和SOD活力明显增高(P<0.05)。通过病理学切片观察,TFEH明显改善肝组织的病理变化。结论TFEH对四氯化碳造成的小鼠急性肝损伤具有保护作用。

地锦草提取物对小鼠血液过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

目的 :观察地锦草提取物对小鼠血液过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响。方法 :地锦草提取物给小鼠连续灌胃 2 3 d,1次 / d,1ml/次。结果 :与空白对照组比较 ,地锦草提取物可明显提高小鼠血液 CAT和 GSH- PX活性 ,并呈剂量依赖性。结论 :结果表明 ,地锦草提取物具有较强的清除自由基及抗氧化。

地锦草体外抑菌作用研究

目的探讨地锦草的体外抑菌作用。方法用K-B纸片扩散法。100%地锦草浸出液滤纸片对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌抑菌作用进行了研究。结果地锦草对以上细菌均有明显抑菌作用。结论地锦草在体外有明显的抑菌作用。

高效液相色谱法测定地锦草中没食子酸的含量

目的建立高效液相色谱法测定地锦草中没食子酸的含量。方法DiamonsilC18色谱柱（4．6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-0．01％磷酸（10：90）；检测波长：273nm柱温：30℃；流速：1mL·min^-1，进样量：5μL。结果没食子酸在0．0t82～0．1824μg线性关系良好，回归方程为Y=2969．4X-4．252，r=0．9999。平均加样回收率为98．36％，RSD为2．83％。结论本方法简便、快速、重复性好，可用于测定地锦草中没食子酸的含量。

地锦草不同提取部位抗皮肤癣菌作用

为研究地锦草不同提取部位的体外抗皮肤癣菌作用。采用大孔吸附树脂梯度洗脱分离法对地锦草乙醇提取物进行洗脱分离,得到五个洗脱部位;根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A),测定地锦草5个提取部位对17株临床常见皮肤癣菌的最低抑菌浓度值(MIC)。结果表明地锦草5个提取部位均有显著的抗真菌作用,其抗真菌有效物质主要集中在20%乙醇和40%乙醇洗脱部分。由此可知,地锦草不同提取部位对试验菌株的生长具有明显地抑制作用。