多脊椎蒙古羊Hoxc8 exon-1和exon-2的序列分析

参考牛的Hoxc8基因序列设计引物,扩增正常蒙古羊(胸椎数13)和多脊椎蒙古羊(胸椎数14)Hoxc8的exon-1和exon-2基因,对得到的序列进行生物信息学分析。结果表明,经序列比对二者的DNA序列,除两侧个别碱基有差异外,中间序列完全一致。蒙古羊Hoxc8的exon-1和exon-2序列分别与其他物种进行同源性比对,蒙古羊Hoxc8 exon-1与人、小鼠、大鼠、犬的同源性达到96%以上,与斑马鱼的同源性为75.8%;exon-2与大猩猩、犬、人、小鼠、大鼠的同源性达到91%以上,与斑马鱼的同源性为74%。

牦牛和普通牛DRB1*Intron1-exon2序列变异分析

为揭示牦牛抗逆性及抗病育种积累更多的分子遗传学资料,通过检测DRB1基因在牦牛和普通牛群体中的变异,分析该基因检测区域遗传参数。以甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛、大通牦牛和普通牛为研究对象。应用PCR-SSCP方法检测BoLA-DRB1基因第1内含子及第2外显子部分序列多态性。DRB1基因第1内含子区检测到4处SNPs及1处插入/缺失突变,第2外显子区检测到17处SNPs,两区域均表现为高度多态;单倍型连锁分析发现21种intron 1-exon 2单倍型组型且存在单倍型连锁不平衡现象,A-A1、A-B1、B-A1和B-B1单倍型在牦牛和普通牛中频率较高;聚类分析表明,牦牛DRB1基因第2外显子区碱基序列与普通牛及山羊的同源性最高,系统进化情况与它们亲缘关系远近一致。牦牛和普通牛BoLA-DRB1基因第1内含子及第2外显子多态性丰富,可作为牦牛和普通牛BoLADRB1的遗传标记。

SIRT1全长(SIRT1-FL)及选择性剪接变异体(SIRT1-△Exon7)在大鼠海马和皮层的表达及其意义

目的明确大鼠神经系统是否存在SIRT1-△Exon7,并初步探讨SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7对神经干细胞分化的影响。方法分别提取新生大鼠海马和皮层的mRNA,应用PCR和RT-PCR方法检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7的mRNA表达水平。结果 SIRT1-△Exon7和SIRT1-FL的mRNA在大鼠海马和皮层均有表达。皮层SIRT1-FL mRNA含量比海马高5.81%(P<0.05),皮层SIRT1-△Exon7 mRNA含量比海马低56.68%(P<0.05)。结论首次发现大鼠神经系统存在SIRT1-△Exon7。SIRT1-FL可能促进了神经干细胞的分化过程,而SIRT1-△Exon7可能发挥相反的作用。

SIRT1选择性剪接变异体SIRT1-ΔExon8 mRNA在幼龄和老龄小鼠海马组织的表达改变及意义

目的:检测小鼠海马组织中是否存在SIRT1选择性剪接变异体SIRT1-ΔExon8及其mRNA在幼龄和老龄小鼠海马组织的表达水平。方法:选取10只50 d(幼龄)和10只12个月龄(老龄)雄性昆明(KM)小鼠,分别提取海马组织的RNA并进行反转录及PCR,通过琼脂糖凝胶电泳检测海马组织中的SIRT1-ΔExon8 mRNA;采用Real-time PCR(RT-PCR)技术检测SIRT1-ΔExon8 mRNA的表达。结果:幼龄和老龄小鼠海马组织均检测到SIRT1-ΔExon8 mRNA;与幼龄组相比,老龄组小鼠SIRT1-ΔExon8 mRNA表达增加。结论:老龄小鼠海马组织的SIRT1选择性剪接变异体SIRT1-ΔExon8 mRNA较幼龄小鼠的表达增加,因此SIRT1-ΔExon8可能参与了衰老的发生,提示通过调控SIRT1-ΔExon8的表达可能会延缓机体的衰老。

沐川乌骨黑鸡LIPE基因第1外显子多态性及其与体重、肌内脂肪含量的关联分析

【目的】探究沐川乌骨黑鸡激素敏感脂酶(hormone-sensitive lipase,LIPE)基因第1外显子单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点的遗传变异,并分析其与体重、肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量的相关性。【方法】采集106只沐川乌骨黑鸡血液,利用PCR扩增和直接测序技术检测LIPE基因第1外显子SNP位点,采用SPSS 21.0软件分析LIPE基因第1外显子SNP位点多态性及其与沐川乌骨黑鸡体重、胸肌IMF含量的相关性;通过生物信息学在线工具分析LIPE基因第1外显子SNP位点对其编码氨基酸的影响;利用实时荧光定量PCR检测LIPE基因在沐川乌骨黑鸡不同组织和不同基因型个体胸肌中的相对表达量。【结果】沐川乌骨黑鸡LIPE基因第1外显子共检测到3个SNP位点,66 bp处SNP位点(SNP1:c.66 A>C)上发现AA、AC和CC 3种基因型;440 bp处SNP位点(SNP2:c.440 A>G)上发现AA和AG 2种基因型;462 bp处SNP位点(SNP3:c.462 G>A)上发现GG和GA 2种基因型。卡方适合性检验表明,沐川乌骨黑鸡LIPE基因第1外显子的SNP2、SNP3位点符号哈迪-温伯格平衡状态(P>0.05),SNP1位点偏离哈迪-温伯格平衡状态(P<0.05)。关联分析表明,SNP2位点的AG基因型个体胸肌IMF含量显著高于AA基因型(P<0.05),各位点不同基因型个体体重均无显著差异(P>0.05)。氨基酸序列比对分析显示,SNP2为非同义突变,其导致赖氨酸变为精氨酸。实时荧光定量PCR结果显示,LIPE基因在脂肪组织中表达量较高,SNP2位点AA基因型个体胸肌中LIPE基因mRNA表达水平极显著高于AG基因型(P<0.01)。【结论】沐川乌骨黑鸡LIPE基因第1外显子存在3个SNP位点,其中SNP2位点对沐川乌骨鸡IMF含量具有显著影响,该位点可作为沐川乌骨黑鸡IMF含量选育的候选分子遗传标记。

TYR基因外显子1的序列变异与家猪的起源研究

为了分析家猪与野猪的遗传多样性及起源,测定了来自12个中国地方家猪品种、3个欧洲引进猪品种以及8个中国野猪和2个越南野猪共36个个体的酪氨酸酶基因(TYR)外显子1的序列,共检出6个单核苷酸多态性位点(SNPs),且这6个位点的变异均为同义突变,根据这些变异可将酪氨酸酶基因DNA序列归结为4种单倍型。结合已发表的数据,构建了简约中介网络图。在网络图中,单倍型TYR*2主要为欧洲家猪与欧洲野猪和3条亚洲家猪染色体。大部分亚洲家猪和野猪共享单倍型TYR*1,表明这是1个亚洲类型的单倍型;同时也有部分欧洲家猪与野猪携带这一单倍型。而单倍型TYR*3和TYR*4为本研究检测到的稀有单倍型,这两种单倍型主要由中国家猪与亚洲野猪组成。这种网络图结构支持家猪的欧洲和亚洲独立起源学说,同时也表明,相当部分的欧洲家猪品种受到亚洲猪的基因渗透,而少量中国家猪和日本野猪也受到了欧洲猪的基因渗透。

陕北白绒山羊HSL基因外显子1的SNPs及其与部分生产性状的相关分析

【目的】探讨陕北白绒山羊激素敏感脂酶(Hormone sensitive lipase,HSL)基因外显子1的SNP遗传多态性及其与产绒、胴体和生长性状的相关关系,为陕北白绒山羊分子标记辅助选择提供理论依据。【方法】测定168只陕北白绒山羊部分生长、胴体指标。利用PCR-SSCP技术分析HSL基因外显子1的SNP遗传多态性。【结果】陕北白绒山羊HSL基因外显子1有AB和AA 2种基因型,在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态;AB与AA基因型个体的绒长差异极显著(P<0.01),体高和背膘厚差异显著(P<0.05),其他性状均无显著差异;AB基因型个体初生重、断奶重、绒长、周岁重、体高、体长、管围、背膘厚大于AA基因型,但AA基因型个体毛长、产绒量、胸围、眼肌面积大于AB基因型。【结论】陕北白绒山羊HSL基因外显子1具有多态性,该基因可能是陕北白绒山羊产绒及胴体性状的主效基因,或者与控制这些性状的主效基因相连锁。

鹅MyoG基因外显子1的克隆及序列分析

肌细胞生成素（myogenin，MyoG）是生肌调节因子MRFs（MyoD、MyoG、Myf5和MRF4）家族的一员，它的表达具有控制成肌细胞融合的起始，促使成肌细胞增殖的作用，使单核成肌细胞转变成为多核的肌纤维，在MyoD家族中具有中心地位。本试验克隆了鹅MyoG外显子1序列，得到其片段长度为438bp，与鸡MyoG基因的同源性为91．9％，与人、牛、猪等哺乳动物同源性为68％-70％，其氨基酸序列与鸡的同源性达到93．8％。核酸进化树显示，鹅、鸡较早地与哺乳类动物分化开来。分析了该区域编码氨基酸的亲水性、相应区域位于表面可能性和平均电荷，以及密码子的使用策略。

牛科物种FSHβ基因外显子1和外显子2遗传特征分析

促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)对刺激动物卵泡发育和促进精子生成具有重要作用,但有关牛科物种FSH基因的群体遗传特征还不十分清楚。本文针对FSHβ基因外显子1和外显子2,采用PCR-SS-CP结合PCR产物直接测序技术对353头水牛(来自11个水牛群体)、30头牦牛和30头大额牛样品进行了群体变异检测,并结合NCBI数据库中已发表的普通牛、山羊和绵羊等物种同源序列进行了群体遗传和生物信息学分析。在FSHβ基因外显子1中,水牛中发现1个核苷酸替换和1个缺失,即c.-49A>G和c.-31delG;其中,SNP-49在河流型和沼泽型水牛中均存在,等位基因c.-49A为优势等位基因,而c.-31delG只存在于沼泽型水牛中,且为杂合状态,基因频率为0.077。在牦牛外显子1中检测到c.-37G>A和c.-12T>C替换,且为连锁遗传的,而在大额牛外显子1中未检测到SNP位点。在FSHβ基因外显子2中,水牛中发现c.132G>A替换,该位点在河流型和沼泽型水牛均存在,但等位基因频率在两类水牛间不一致。在牦牛外显子2中检测到c.9C>T和c.21C>T替换,该替换也存在于普通牛中;大额牛外显子2为单态,未见SNP位点。生物信息学分析显示,在一些牛科物种FSHβ基因外显子2中发现的SNP位点均为同义替换,揭示了其序列的高度保守性。在牛科物种中,山羊和绵羊FSHβ基因第36位密码子编码氨基酸与其他物种不同,可作为区分它们的遗传标记。

藏猪肌肉生长抑制素基因外显子1的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了藏猪肌肉生长抑制素(MSTN)基因的单核苷酸多态性。根据GeneBank上猪MSTN基因全序列设计的两对引物,扩增了MSTN基因完整的外显子1,经SSCP分析,只有P1扩增产物存在多态性,表现为3种基因型(AA、AC和CC),A和C两种等位基因的频率分别为46.88%和53.12%。测序分析发现,CC型与AA型相比在MSTN基因编码区的第71bp处有一个A→C的单碱基突变,该突变导致编码的第24位氨基酸由天冬酰胺改变为苏氨酸。

黑龙江省东部地区汉族人群PCSK9基因第1外显子多态性与脂代谢的相关性

目的 研究黑龙江省东部地区汉族人群前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK)9基因第1外显子多态性与脂代谢的相关性.方法 因心绞痛和(或)运动试验阳性及有冠脉管腔狭窄证据而需入院行冠状动脉造影者220例中,110例冠心病(CHD)者为病例组,110例非CHD者为对照组,检测PCSK9基因第1外显子基因多态性及血脂水平,并对基因多态性与血脂水平进行相关性分析.结果 共发现c.121C>G、c.299C>T、c.427-428insGCT、A53V、P56S和c.556A>G 6个突变位点,其中在A53V突变位点上发现CC和TC两种基因型,但未发现TT基因型.病例组和对照组各基因型间血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平差异具有统计学意义(P<0.05).病例组中TC基因型血清TG、TC和LDL-C水平均显著高于CC基因型(P<0.05);对照组中TC基因型血清TC水平显著高于CC基因型(P<0.05).结论 PCSK9基因第1外显子在黑龙江省东部地区汉族人群中存在多态性,且与CHD患者脂代谢有关.

CTLA-4基因多态性与豫南地区汉族人群1型糖尿病的相关性

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)基因第一外显子+49 A/G的多态性与豫南地区汉族人群1型糖尿病(T1DM)的相关性。方法采用PCR-RFLP技术分析108 T1DM患者及100例正常对照组的CTLA-4基因第一外显子+49 A/G多态性。结果 T1DM组等位基因+49G频率明显高于正常对照组(P=0.001),基因型GG明显高于正常对照组(P=0.005)。结论 CTLA-4基因第一外显子+49 A/G多态性与豫南地区T1DM易感性相关。

德国牧羊犬FSHR基因第1外显子SNP T89C与产仔数关系研究

为了研究FSHR基因与产仔数的关系,试验以警用德国牧羊犬种母犬基因组为模板,应用PCR技术克隆FSHR基因第1外显子,测序检测单核苷酸多态性(SNP)T89C位点,并进一步分析基因型对产仔数的影响。结果表明:FSHR基因第1外显子SNP T89C CC基因型个体产仔数显著少于TT基因型个体产仔数(P<0.05),说明SNP T89C位点与德国牧羊犬产仔数存在相关性。

应用实时荧光定量PCR技术检测常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征的DJ-1基因外显子重排突变

目的:建立应用实时荧光定量PCR技术(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测DJ-1基因外显子重排突变的技术平台,并应用该技术对常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征(autosomal recessive early-onset Parkinsonism,AREP)DJ-1基因进行外显子重排突变分析。方法:应用实时荧光定量PCR分析方法,对22个AREP家系先证者和30个正常对照的DJ-1基因进行外显子重排突变分析。结果:本研究中获得了扩增效率和特异性均满意的DJ-1基因各编码外显子实时荧光定量PCR反应条件及各外显子引物;本组AREP患者未发现DJ-1基因的外显子重排突变。结论:建立了应用实时荧光定量PCR技术进行DJ-1基因外显子重排突变检测的技术平台;中国人群AREP患者DJ-1基因外显子重排突变可能罕见。

水牛、大额牛和牦牛抑制素α亚基编码基因外显子1多态性分析

为了揭示牛科物种INHA基因的遗传特征,该文采用PCR产物直接测序法对水牛、大额牛和牦牛INHA基因外显子1及其侧翼序列进行多态性检测,并结合已发表的包括牛科物种在内的一些哺乳动物数据进行了比较分析。结果表明,在水牛INHA基因外显子1中存在c.73C>A替换,为同义替换,河流型和沼泽型水牛编码产物一致;在大额牛的INHA基因外显子1中发现c.62C>T、c.187G>A替换,分别引起INHA中氨基酸发生p.P21L、p.V63M改变,两者均为相同性质氨基酸的替换;在牦牛中发现c.62C>T、c.129A>G替换,前者也引起编码氨基酸发生p.P21L替换,后者为同义替换。在INHA基因5'侧翼区所测出的序列中,水牛、大额牛和牦牛等物种内均未发现SNP位点,但在种间发现存在c.-6T>G的替换,大额牛、牦牛和普通牛均为c.-6G,而水牛为c.-6T。在INHA基因内含子中,水牛的第31～36位核苷酸处发现有6个碱基的缺失,即c.262+31_262+36delTCTGAC;该位点在河流型水牛中野生型(+/+)占主体,而在沼泽型水牛中则缺失型(-/-)占主体。在大额牛、牦牛和普通牛等其它牛科物种的内含子中均未发现该缺失,但与水牛相比,大额牛、牦牛和普通牛内含子中发现缺失c.262+78_262+79delTG。序列比对显示,INHA基因外显子1序列中c.43A和c.67G为水牛中所特有,而c.173A和c.255G为大额牛、牦牛和普通牛所共有,c.24C、c.47G、c.174T和c.206T为山羊所特有。大额牛、牦牛和普通牛间INHA基因外显子1序列差异较小,而山羊和水牛与它们间的差异相对较大。

子宫颈癌抑癌基因p16第一外显子CpG岛异常甲基化

利用限制性核酸内切酶-PCR方法分析33例肿瘤组织和15例正常组织抑癌基因p16第一外显子SacⅡ和SmaⅠ酶切位点甲基化,应用SPSS软件进行统计分析。结果显示,18例子宫颈癌在抑癌基因p16第一外显子SacⅡ位点甲基化,8例子宫颈癌在SmaⅠ位点甲基化。正常组织仅有两例在抑癌基因p16第一外显子SacⅡ位点甲基化,正常组织在SmaⅠ位点没有甲基化。另外,抑癌基因p16第一外显子SacⅡ和SmaⅠ酶切位点甲基化易发生在肿瘤的早期。抑癌基因p16第一外显子SacⅡ和SmaⅠ酶切位点甲基化与子宫颈癌相关。

一单纯性晶状体异位家系的基因型及临床表型研究

目的对一单纯性晶状体异位(IEL)家系患者的致病基因进行筛查,并分析该家系临床特征。方法该研究纳入一IEL家系共5代48例成员。收集家系成员外周血样本,并通过全身体格检查及眼科常规检查观察临床表现特点。采用全外显子组测序(WES)技术对家系中2例患者进行致病基因筛查。通过对家系其他成员及200例正常对照人群进行基因靶向Sanger测序验证。并采用SIFT、PolyPhen和MutationTester软件预测蛋白功能。结果该家系共13例IEL患者,以常染色显性模式遗传,平均发病年龄为51.5岁。临床特征主要为晶状体异位伴前倾向前房,前房变浅,房角变窄,最终导致继发性青光眼。通过筛选及验证显示家系所有患者均携带原纤维蛋白基因-1(FBN1)基因c.3463G>A突变,在200例对照人群中未发现该突变。SIFT、PolyPhen和MutationTester功能预测软件均提示该突变影响蛋白功能。结论该IEL主要临床表型是晶状体异位伴前倾导致继发性青光眼。FBN1基因的c.3463G>A可能是导致该家系IEL的致病突变。

中国人NF1基因突变分析

目的通过对28个家系56例Ⅰ型神经纤维瘤病患者NF1-GRD相邻外显子进行突变检测,探讨和分析中国人NF1基因的突变规律、突变类型、机制以及与临床表型的相关性,以期发现潜在的突变热点。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性和(或)异源双链分析(SSCP/HA)技术,结合DNA测序方法,对56例Ⅰ型神经纤维瘤病患者的NF1基因第20、28、29、39号外显子的突变或多态性进行筛查。结果在所检测的28个家系中有一家系父子3例Ⅰ型神经纤维瘤病患者的NF1基因第20号外显子均出现异常移动的电泳条带,重复检测单链构象多态实验无异常发现,而异源双链实验则仍显示有1条移动异常的双链电泳条带,DNA测序证实为该家系第20号外显子上T→G的杂合性突变,即Leu1141Arg错义突变。同时发现,另1例Ⅰ型神经纤维瘤病患者的第28号外显子亦表现为电泳条带移动异常,测序证实为第28号外显子5'端上游第28位核苷酸G→T杂合子。未发现第29号和39号外显子电泳条带移动异常。结论聚合酶链反应-单链构象多态性与异源双链分析联合应用,可提高Ⅰ型神经纤维瘤病基因突变检测的敏感性和阳性检出率。所测28个家系56例患者NF1基因的第20、28、29及39号外显子并非突变热点或突变率相对较高的区域。

系统性红斑狼疮患者血清中Tim-1蛋白水平及其基因多态性

目的:检测T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-1(Tim-1)在系统性红斑狼疮患者和健康对照组血清中的浓度,比较不同基因型间Tim-1蛋白的浓度,及其基因第4外显子插入/缺失多态性,分析其与系统性红斑狼疮的关系。方法:采用ELISA方法测定Tim-1蛋白在血清中的浓度;PCR反应检测TIM-1的第4外显子插入与缺失多态性,计算基因型与等位基因的频率。结果:系统性红斑狼疮患者和健康对照组血清中Tim-1蛋白的浓度分别是:(263.083±276.953)和(58.527±92.424)pg/ml,两组之间的差异有统计学意义;SLE患者TIM-1的第4外显子缺失/缺失纯合子与缺失/插入杂合子的Tim-1蛋白的浓度分别为(307.360±284.079)和(191.750±256.708)pg/ml,两组之间无显著性差异。健康对照组TIM-1的第4外显子缺失/缺失纯合子与缺失/插入杂合子的Tim-1蛋白的浓度分别为(70.295±109.917)和(40.468±41.739)pg/ml,两组之间无显著性差异。对照组的TIM-1的第4外显子缺失/缺失纯合子,缺失/插入杂合子,插入/插入纯合子基因型频率分别是0.617,0.321,0.062;系统性红斑狼疮患者相应的基因型频率是0.652,0.326,0.022。两组之间无显著性差异。结论:Tim-1蛋白在系统性红斑狼疮患者血清中的浓度升高,与系统性红斑狼疮的正相关。但是第4外显子插入与缺失多态性与系统性红斑狼疮无相关性,该突变不改变Tim-1蛋白在血清中的水平。

限制性内切酶介导的重叠延伸在人环氧合酶-1(COX-1)基因克隆中的应用

建立一种用于克隆全长基因的、限制性内切酶介导的重叠延伸法 .对全长基因进行分段扩增 ,并利用适当的限制性内切酶对基因序列内相应的限制性位点进行酶切 ,从而使分段扩增片段得以重叠并互为模板 ,在DNA聚合酶的作用下延伸获得全长基因 .将环氧合酶 1 (COX 1 )基因的外显子 9巧妙地拼接到了缺失外显子 9的COX 1cDNA片段中 ,获得了COX 1基因的全长cDNA .该方法分 3步进行 .首先 ,通过RT PCR分别扩增跨外显子 9的cDNA片段和缺失外显子 9的cDNA片段 ,并克隆到pMD1 8 T载体上 ;其次 ,PCR扩增外显子 9片段 ,限制性内切酶StuI酶切缺失外显子9cDNA片段的重组质粒 ,二者以一定的比例混合 ,互为模板 ,在pfuDNA聚合酶的作用下进行延伸 ,从而产生一个双链的DNA分子 .最后 ,以延伸产物为模板 ,用COX 1cDNA两端的引物进行PCR扩增 ,产生包含外显子 9的COX 1基因的全长cDNA .这种限制性内切酶介导的重叠延伸方法 ,对于克隆mRNA剪接水平上受调控的基因尤为有用 。