一种新的基于适体和酶切保护分析的超灵敏蛋白质检测方法

以凝血酶适体(aptamer)为例,利用适体和核酸外切酶特性,通过定量PCR扩增建立一种高灵敏的蛋白质检测方法.首先合成3段寡核苷酸序列即凝血酶适体探针,上游连接子和下游连接子.将适体探针与凝血酶温育结合后,再加入核酸外切酶I降解未能结合的探针.接着将保护下来的探针与连接子杂交、连接和对连接产物进行定量PCR .分别建立连接产物标准品浓度与Ct 值的标准曲线和凝血酶浓度与连接产物浓度的标准曲线,通过定量PCR对凝血酶进行定量.结果显示,基于适体的外切酶保护凝血酶检测方法灵敏度较高,连接产物标准品浓度的对数值和Ct 值之间的方程为y =- 2 95x + 33 6 5 (R2 =0. 990 ,P <0 .0 1) ;凝血酶浓度和连接产物浓度对数值之间的方程为y =0 94x - 0 . 2 9(R2 =0 . 998,P <0 . 0 1) ,还对可能影响检测的有关参数举行了探讨.

外切酶保护PCR快速检测垃圾焚烧飞灰中二噁英类化合物

[目的]利用外切酶保护PCR分析(exoucleaseprotectionmediated-PCRassay,EPM-PCR)方法检测焚烧炉飞灰中的二(?)英类化合物(dioxins-likechemicals,DLCs)的毒性当量(toxicequivalencyquantities,TEQs)。[方法]将两份5g飞灰样品经过抽提、浓缩及纯化等前处理步骤后,采用EPM-PCR方法检测其中的二(?)英类化合物的TEQs。与高分辨气相色谱-质谱联用技术(high-resolutionchromatographycombinedwithhigh-resolutionmassspectrometry,HRGC-HRMS)检测结果相比较,分析其差异原因。[结果]两份垃圾焚烧飞灰样品TEQs值分别为1288ng/kg和16000ng/kg,相当于根据HRGC-HRMS检测结果估算出来的TEQ值的1.61倍和2.63倍。EPM-PCR检测TEQ值偏高可能由于检测物中包含一些被化学方法排除的物质(如多氯联苯)造成。[结论]结合有效的前处理过程,EPM-PCR可快速地用于实际样品的定性与定量检测。

利用酶切保护PCR检测鱼肉中二吨恶英类化合物

目的探讨利用酶切保护PCR分析(EPM-PCR)检测鱼肉中二吨恶英类化合物(DLCs)的毒性当量(TEQs)的可行性。方法将2份1g鱼肉样本经过硝化、提取及净化步骤以后,采用EPM-PCR分析方法检测其中TEQs,并与高分辨率气相色谱-高分辩率质谱联用技术(HRGC-HRMS)的检测结果进行比较。结果两份鱼肉样本经酶切保护PCR分析得到的TEQs值分别是10.92pg/g和39.61pg/g,相当于HRGC-HRMS标准方法的2.91倍和3.68倍。结论EPM-PCR可作为有效的筛选鱼肉样本中DLCs的一种手段。