锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白(KHV-MEP)的功能及锦鲤疱疹病毒(KHV)的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤(Cyprinus carpio Koi)肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段。将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件TMpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2。所获得的基因片段大小为771bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因(AB178537)的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点(PI)为8.65。该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇。结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因。

人CIDE3基因克隆和真核表达载体构建及促凋亡作用的研究

目的:克隆人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子3(CIDE3)全长基因,构建真核表达质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3,并检测其促凋亡作用。方法:①提取人腹部皮下白色脂肪组织的总RNA,经RT-PCR获得CIDE3全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.l(+),构建重组质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3,并进行序列测定。②用脂质体法将pcDNA3.l(+)-CIDE3转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,通过TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果:①经RT-PCR扩增得到特异性717 bp的目的片段,构建的重组质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3经序列测定,结果与Genbank发表的序列完全一致。②转染Hela细胞后,经Tunel染色法检测发现,转染pcDNA3.l(+)-CIDE3后有大约25%的细胞发生了凋亡,与转染空质粒pcDNA3.l(+)(<5%)及未转染质粒的细胞相比,其凋亡细胞明显增多。结论:成功克隆了人CIDE3全长基因,构建了真核表达质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3,并验证了CIDE3基因可诱导细胞发生凋亡的生物学作用,为进一步研究CIDE3的生物学功能奠定了坚实基础。

利用Cre/loxP重组系统构建甜菜碱合成酶多基因表达载体

通过使用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体构建系统,将辽宁碱蓬（Suaeda liaotungesis kitag）的胆碱单加氧酶（CMO）基因、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因以及烟草的核基质结合区（MAR）序列构建到同一表达载体上,得到可直接用于农杆菌转化的植物表达载体pYLTAC747H-MAR-BADH-CMO-MAR.该甜菜碱合成酶多基因表达载体的成功构建为进一步进行植物的遗传转化,以有效提高转基因植株的耐盐性提供了实验基础.实验中,用热激法替代了电击法进行质粒的大肠杆菌转化,并去掉了透析等步骤,简化了构建过程.

拟南芥rd29A的功能鉴定及植物表达载体的构建

利用PCR技术从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中分离了rd29A基因上游420 bp的调控序列,序列分析表明,该片段与已报道的rd29A启动子有100%的同源性,包括DRE、ABRE等顺式作用元件.用rd29A启动子构建了具有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体,通过基因枪导入法转化甘蔗愈伤组织,经过抗性筛选获得再生植株,在PEG胁迫下,用荧光显微镜观察到s65t(GFP)基因在愈伤组织和叶片中表达,通过PCR鉴定获得了5株转基因植株.同时本文还构建了由rd29A调控的DREB2B基因的植物表达载体rd29A-dreb-hyg.

臭牡丹总黄酮对A549细胞上皮间质转化相关蛋白的影响

目的观察臭牡丹总黄酮对A549肺腺癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的影响。方法构建β-catenin真核过表达载体并转染A549细胞,将细胞分为空载组、β-catenin过表达组、空载组+臭牡丹总黄酮组、β-catenin过表达+臭牡丹总黄酮组。MTT法检测不同浓度的臭牡丹总黄酮对A549细胞体外增殖的抑制作用。实时定量PCR检测各组β-catenin m RNA的表达,Western Blot检测各组β-catenin、E-Cardherin、Vimentin的蛋白水平。结果 MTT显示A549细胞活力随臭牡丹总黄酮浓度的增加受到明显抑制,IC50为2.1 mg/m L。β-catenin过表达组较空载组的β-catenin、Vimentin表达均明显上调,E-cardherin表达下调。臭牡丹总黄酮在空载组与β-catenin过表达组均能明显降低β-catenin m RNA与蛋白水平,增加E-cardherin蛋白表达,略微降低Vimentin蛋白表达。结论臭牡丹总黄酮对A549肺癌细胞具有一定的体外抑制增殖作用,其抗肿瘤作用的可能机制是通过调控EMT的相关蛋白从而逆转β-catenin诱导的EMT现象而起作用。

植物抗体基因工程：Ⅲ．马铃薯Y病毒小鼠中和抗体链基因的序列分析及其植物表达载体的构建

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体轻链基因（Ｋ６）全长为９５６个核苷酸碱基（不包括ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴），其中包括５＇端非编码区３１个核苷酸碱基，编码轻链信号肽的５７个核苷酸碱基，编码成熟蛋白的６５７个核苷酸基和３＇端非编码区的２１１个核苷酸碱基。与已知的其它Ｋ轻链基因（ＭＲＫ１６）相比，核苷酸的序列同源性为９８．７％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９７．０％，其变异主要发生在三个抗原识别位点内（ＣＯＲ）。将完整的抗体轻链基因正向插入植物表达载体ｐＢ１２１中的原ＧＵＳ基因位置上，置于花椰菜花叶病毒３５Ｇ启动子控制之下，获得了能够在植物细胞内表达马铃薯Ｙ病毒中和抗体轻链基因的植物表达载体ｐＹＬ。

突变型PUMA质粒的构建及表达

目的构建促凋亡基因p53上调凋亡调制物(PU-MA)的真核表达载体和针对其磷酸化位点定点突变的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础。方法通过PCR方法从pCEP4-(HA)2-PUMA质粒中扩增PUMA基因,并克隆到pIRES2-EGFP载体上,构建PUMA真核表达载体pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA,利用定点突变技术构建pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA-T28G,行PCR及测序鉴定;脂质体分别将两种质粒转染Hela细胞,同时设未转染的阴性对照组及转染空载体组(4个实验组);PI染色观察PUMA对细胞的促凋亡作用;流式细胞仪检测细胞凋亡率;RT-PCR检测PUMA的表达;Western blot检测突变型PUMA蛋白和标签蛋白的表达。结果经PCR及测序结果表明,正确构建野生型、突变型PUMA重组质粒,PUMA基因第10位氨基酸的第28～30位碱基由丝氨酸(TCC)突变为丙氨酸(GCC),其他碱基均无突变;野生型、突变型PUMA重组质粒转染Hela细胞荧光显微镜观察到绿色荧光,而PI染色观察到野生型、突变型PUMA对Hela细胞的促凋亡作用;流式细胞术检测结果显示突变型和野生型PUMA转染组凋亡率高于阴性对照组和空载体转染组;Western blot和RT-PCR检测出目的基因的高表达。结论成功构建了PUMA基因及其定点突变载体,为深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻译后调节奠定基础。

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因痘苗病毒表达载体的构建及序列分析

应用反转录巢式PCR扩增出丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因,并克隆到痘苗病毒表达载体pSC65中。载体上设计一测序引物,经序列测定证明,已将543个bp长的丝氨酸蛋白酶基因片段正确插入载体。此结果为丙型肝炎病毒NS3区丝氨酸蛋白酶基因在痘苗病毒中的表达,以及建立HCV特异的CTL靶细胞打下基础。

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。

重组人RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12-Fc融合蛋白载体的构建和表达

目的用p IRES2-EGFP-Fc载体构建重组人RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12(MED12)-Fc真核表达质粒,转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达MED12-Fc融合蛋白,纯化和鉴定MED12-Fc。方法根据Gen Bank中的序列信息,从基因组上扩增出人MED12基因第2、3和4外显子,并通过Overlap聚合酶链反应(PCR)拼接获得目的基因片段,以p IRES2-EGFP-Fc真核表达质粒为载体,构建重组人MED12-Fc真核表达质粒。使用脂质体瞬时转染293T细胞,48 h收集上清液,用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定质粒的表达能力。表达质粒电转CHO细胞,通过G418抗性筛选及流式细胞仪荧光筛选,获得高表达的稳定细胞株。使用稳定细胞株培养表达人MED12-Fc融合蛋白,收集上清液,用Proein A亲和纯化柱纯化蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)检测蛋白质分子量。结果通过DNA测序和瞬时转染表达鉴定,证实MED12第2、3和4外显子基因序列正确,成功获得重组人MED12-Fc真核表达质粒。通过电转化、G418及流式细胞仪荧光筛选,获得高表达重组人MED12-Fc的稳定表达细胞株。通过细胞培养,亲和层析纯化,获得高纯度的重组人MED12-Fc融合蛋白。结论成功构建MED12-Fc融合蛋白的表达载体,获得高纯度的重组人MED12-Fc融合蛋白,为进一步研究MED12蛋白功能奠定基础。

SPRR1A基因真核荧光表达载体的构建

目的:构建可在真核细胞中表达SPRR1A(small proline-rich repeat protein1A)的荧光表达载体。方法:应用PCR技术扩增出编码SPRR1A的全长基因,将SPRR1A DNA克隆到pEGFP-N1质粒,通过抗性基因筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定。结果:酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank提供的序列(L05187)一致。结论:成功构建了SPRR1A真核荧光表达载体。

靶向ING1基因的miR-622真核表达载体在胃癌细胞MKN-45中的鉴定及其功能

目的:研究构建靶向ING1基因的miR-622真核表达载体并验证其转染人胃癌细胞株MKN-45细胞后对ING1基因的干扰效果及其功能.方法:将外源性重组真核表达载体pSuper/miR-622转染到人胃癌细胞株MKN-45内,经G418筛选并建立高表达miR-622的稳定转染胃癌细胞株.稳定表达该miR-622的胃癌细胞为:MKN-45-pSuper/miR-622组,转染空质粒细胞及未处理细胞为对照组(MKN-45-pSuper组和MKN-45组),采用实时荧光定量PCR验证miR-622在稳定转染细胞的表达,蛋白印迹检测其对ING1基因表达的干扰效果,通过细胞增殖和周期实验验证miR-622在胃癌细胞MKN-45中的功能.结果:与pSuper空载体组相比,转染了pSuper/miR-622高表达质粒的MKN-45细胞中ING1蛋白表达明显减少,降低了4.63倍(1.83±0.86vs8.47±1.43,P<0.05);与转染pSuper空载体的MKN-45细胞对照组相比,转染了pSuper/miR-622高表达质粒的MKN-45细胞地促进了胃癌细胞增殖(P<0.05),而转染了pSuper空载体的MKN-45细胞组与正常组组间无统计学意义(P>0.05).pSuper/miR-622组在胃癌细胞G0/G1期为21.45±0.16而pSuper空载体组48.21±0.34;pSuper/miR-622组在胃癌细胞G2/M期为53.67±0.41而pSuper空载体组20.27±0.18,与pSuper空载体组细胞相比较,miR-622的高表达促进了胃癌细胞周期的演化.结论:miR-622真核表达载体构建和稳定表达胃癌细胞筛选成功,为继续深入的研究miR-622在胃癌中的功能奠定了基础.

过表达hsa-miR-145对人恶性多发性畸胎瘤细胞增殖凋亡的影响

通过构建hsa-miR-145的重组体pGenesil-1-miR-145,并瞬时转染到人恶性多发性畸胎瘤细胞(NTERA-2)后,利用qRT-PCR法检测hsa-miR-145,以及肿瘤发生相关基因OCT4,SOX2,c-Myc,KLF4,FSCN1在转录水平的表达差异;同时利用MTT法和流式细胞术Annexin V-APC/7-AAD双染法检测hsa-miR-145对NTERA-2细胞增殖的生物学效应和细胞凋亡的影响.结果表明:hsa-miR-145的高表达导致NTERA-2细胞增殖明显减弱,凋亡率增加;转染重组质粒hsa-miR-145后,OCT4,SOX2,c-Myc,FSCN1基因的表达量均有所降低,提示miR-145的过表达可能通过抑制靶基因的表达从而影响生殖肿瘤细胞的生物学功能.

圆红冬孢酵母磷酸盐饥饿诱导表达载体的构建

【目的】建立一种适用于圆红冬孢酵母代谢工程的磷酸盐饥饿诱导表达系统。【方法】对圆红冬孢酵母pho89基因5'侧翼序列进行生物信息学分析,设计相应引物,PCR扩增pho89基因启动子(p PHO89)和hsp70基因终止子(t HSP),利用RF克隆方法置换出发载体上的p PGK组成型启动子和t NOS终止子,以潮霉素磷酸转移酶基因hyg为报告基因,得到响应磷酸盐饥饿诱导的单表达盒载体p ZPK-p PHO89-hyg-t HSP,利用ATMT方法转化圆红冬孢酵母,通过转化子潮霉素抗性表型鉴定p PHO89和t HSP的启动子和终止子活性。在此基础上,构建了适合外源基因表达的双表达盒诱导表达载体p ZPK-HYG-p PHO89-MCS-t HSP,并利用该载体构建了苹果酸酶重组表达菌株。【结果】成功构建了响应磷酸盐饥饿的圆红冬孢酵母诱导性表达载体,该载体在圆红冬孢酵母中可表现出启动子和终止子活性。【结论】该启动子受磷酸盐浓度的严谨调节,响应度高,操作简单,无需额外诱导剂,经济便捷,为后续圆红冬孢酵母代谢工程研究提供了基本材料。

洋葱光周期途径转录因子基因AcCOL7的克隆及功能鉴定

以洋葱品系‘SA2’为材料,克隆到1个光周期途径重要转录因子CONSTANS-like基因,命名为AcCOL7,其cDNA序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸。多序列比对和结构域分析表明,AcCOL7蛋白包含1个B-box型锌指结构和1个CCT结构域;系统发育分析结果显示它与水稻OsCOL13亲缘关系较近;实时荧光定量PCR分析显示,AcCOL7的表达量在抽薹前幼叶中最高,幼嫩花茎次之。为了解AcCOL7的功能,构建了其过表达载体,转化拟南芥co突变体。与突变体植株相比,转化株表现为早花,且突变体的其他变异性状也得到了一定程度的恢复,表明AcCOL7与拟南芥的AtCOL5具有相似的功能,即在光周期诱导开花途径中具有显著的促进开花作用。