盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定

目的:盘状结构域受体2(discoidin domain recep-tor2,DDR2)是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶,研究DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)软骨破坏和肿瘤转移中的作用.方法:在毕赤酵母中表达DDR2胞外区片段(不含信号肽和跨膜区,命名为DR),并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定,以备将来用作DDR2的特异性阻断剂.结果:获得了两株较高表达His-DR融合蛋白的毕赤酵母克隆;其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的18%;经Ni-NTA(nitric-tri-acetic acid)柱纯化后,获得了纯度约90%以上的可溶性His-DR融合蛋白;竞争结合抑制实验显示,His-DR具有阻断和细胞表面天然DDR2受体结合的功能.结论:所表达的融合蛋白His-DR具有抑制天然DDR2功能的作用.

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因,获得其胞外段的原核表达产物。方法:采用RT-PCR方法,从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA,扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:从健康产妇胎盘总RNA中,扩增获得约1300bp的DNA片段,克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN。从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因,构建重组表达质粒pET-41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST,鉴定其相对分子质量(Mr)为66000,Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合。结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因,并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST,为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础。

鸡催乳素受体胞外域的分子克隆及原核表达

根据家鸡催乳素受体基因胞外域序列（GenBank号：D13154）设计并合成1对覆盖编码区58～1249位核苷酸的引物，以家鸡垂体总RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片断，将该片断克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌Ecoli DH5α永久保存．通过设计第2对引物扩增PRLR胞外域cDNA片段，该片段经酶切后克隆到表达载体pRSETA的EcoRⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，构建重组质粒pR-PRLR．该质粒在转化感受态细菌E．coli B121（DF．3）后，在IPTG诱导下促使重组菌表达了相对分子质量为53640左右的重组融合蛋白，表达量在0．1mmol／L IPTG诱导5h时达到最高，约占总菌体蛋白的17．6％左右．表达产物可经体积分数为50％的Ni-NTA凝胶纯化，说明重组蛋白中具有正确的His-tag标签及之后的鸡催乳素受体编码区胞外域序列．

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素(Leptin)成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列(GenBank号:GQ240885.1)和猪瘦素受体基因胞外域序列(GenBank号:AF167719.1)分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位(成熟肽编码区)和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21(DE3)中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。

人促甲状腺素受体膜外区蛋白在原核系统表达及其生物活性鉴定

为研究重组人促甲状腺素受体 (hTSHR)膜外区表达产物及其生物活性与免疫活性 ,将hT SHR膜外区编码基因 (编码第 3～ 4 2 0位氨基酸 )重组到表达型质粒pGEX 4T 3上 ,测序结果表明序列正确 ,未改变读码框架 .然后转入E .coliAd4 94进行诱导表达 .纯化后的表达产物经SDS PAGE、Western印迹及放射受体法分别检测其分子量、免疫活性和生物活性 .重组TSHR3～ 4 2 0 膜外区蛋白 (简称TSHR3～ 4 2 0 )产率为 15 9～ 2 0 2 μg L培养基 ,分子量为 4 8.9kD ;融合蛋白 (简称GST TSHR3～ 4 2 0 )分子量为 75 .4kD .两种表达产物都可与TSHRAb反应 ;TSHR3～ 4 2 0 可与12 5I TSH结合 .

人TLR2和TLR4胞外区cDNA的克隆

目的从脂多糖诱导的外周血单个核细胞克隆人Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)胞外区cDNA。方法用不同浓度脂多糖在不同时间刺激单个核细胞后提取总RNA,RT-PCR方法半定量测定TLR2和TLR4的表达,应用pUCm-T载体克隆胞外区cDNA,双酶切以及DNA测序进行鉴定。结果单个核细胞在四种浓度脂多糖刺激3h、6h和12h后,TLR2和TLR4表达并不相同。15μg/mL脂多糖作用6hTLR2表达最高,10μg/mL脂多糖作用3hTLR4表达最高。经RT-PCR扩增TLR2和TLR4胞外区cDNA分别为1700bp和1900bp,T载体克隆、酶切鉴定及测序分析后证实,目的片段与GenBank中序列一致。结论脂多糖的诱导对外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达有显著影响,并且成功克隆了胞外区cDNA。

编码ATR的胞外区基因cDNA的克隆、测序及表达

目的克隆并在大肠杆菌中表达编码炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor,简称ATR)的胞外区基因。方法收集CHO-K1细胞,提取其总RNA,经反转录成单链cDNA,以此为模板PCR扩增出编码ATR胞外区基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后,亚克隆入表达载体pMal-c2x中进行表达。结果利用所设计的引物扩增出完整的编码ATR胞外区基因。以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的39%。结论获得了编码ATR胞外区基因cDNA及其原核表达产物,为进一步研究炭疽毒素致病机理和炭疽病的防治奠定了基础。

脂质体包裹人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒的构建

目的:构建阳离子脂质体包裹的人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒。方法:PCR扩增穿梭质粒PHMCMVTSHR289目的基因并连接于真核表达质粒pcD NA3.1+上,重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289采用酶切及测序法鉴定。阳离子脂质体包裹重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289。结果:重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289用Hind III酶切后产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测显示出现512bp条带。正向测序发现AAC突变为AAT,为同义突变。反向测序发现GCG突变为GCT,亦为同义突变。阳离子脂质体与重组质粒的体积质量比例为3∶1。结论:酶切及测序鉴定重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289构建成功。

HLA-A胞外区成熟肽基因的克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中HLA-A胞外区成熟肽基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从健康人血液中扩增HLA-A胞外区基因,扩增产物进行T-A克隆、测序.结果表明,获得的HLA-A胞外区基因大小为819bp,与模板序列的同源性为96%.利用基因重组技术,将HLA-A胞外区基因亚克隆入pET-21a(+)载体中.经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET–21/HLA-A中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET–21/HLA-A.

5类等位基因鸡BF2胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化

从鸡脾脏中提取总RNA，以总RNA为模板，5＇-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-（T）15—3’为反转录引物，采用TaKaRa AMV反转录酶合成First—strand cDNA（fcDNA）。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列，设计了含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的2对引物，分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后，插入到含LaeZ基因的原核克隆载体pGEM—T Easy中，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定，筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector，构建重组质粒p2X／BF2（1—5）。将重组表达质粒转化人大肠杆菌TB1感受态细胞，筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。结果表明，本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列，试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子，全长约807～819bp，编码约269～273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化，并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC工类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。

HER-2neu胞外区基因疫苗的免疫避孕作用

目的 :研究HER 2 neu胞外区基因疫苗在免疫避孕中的作用。方法 :构建含人HER 2 neu胞外区的重组质粒pcDNA3 hECD ,以该质粒转染真核细胞C2 C1 2 或注射小鼠股四头肌 ,检测其在体内外表达情况 ;以该质粒基因免疫雌性BALB C小鼠 ,部分小鼠于第 12周以重组蛋白hECDu加强免疫 ,以ELISA方法检测抗HER 2 neu抗体应答 ,3H TdR掺入法检测细胞免疫应答 ,并观察其诱导免疫避孕的情况。结果 :C2 C1 2 转染上清及小鼠股四头肌注射局部均可检测到hECD蛋白的表达。小鼠经基因免疫后可产生较高水平抗体应答 ,抗体水平至少维持 2 8周 ,同时可检测到较高水平细胞免疫应答 (pcDNA3 hECD与对照组SI值分别为 9 5 5和 1 2 5 ) ;基因免疫后小鼠平均产仔数 (3 8± 2 9,对照组为 9 7± 1 6 )明显降低 ,以蛋白加强免疫后产生特异性回忆反应 ,平均产仔数进一步降低 (2 0± 1 7)。而且 ,免疫小鼠产后 4天子宫及卵巢与正常产后鼠相比均无明显区别。结论 :基于HER 2 neu胞外区的基因疫苗免疫小鼠可诱导有效的免疫应答并产生一定免疫避孕效果 ,并且这种避孕作用经特异性蛋白加强免疫可进一步得以提高。

大鼠SR-BI胞外域与ApoA-I蛋白相互作用的确认

先以含全长SR-BIcDNA序列的重组质粒pMD18-T-rS为摸板进行PCR反应扩增SR-BI得到胞外域cDNA片段,经测序证明正确后,定向克隆到酵母双杂交表达载体,然后与pGBKT7-ApoA-I质粒共转化酵母细胞,通过报告基因及酵母交配试验确认了SR-BI的胞外域部分和ApoA-I之间的确存,观察到ApoA-I与SR-BI胞外域间的相互作用力比与全长的SR-BI间的相互作用力提高了10%。

稳定表达EGFR胞外区的NIH3T3细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外区(EGFRex)的NIH3T3细胞株。方法构建带有EGFRex基因的重组真核表达质粒PLNCX2-EGFRex,经脂质体法转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,用免疫组化和蛋白质印迹(Western blot)检测EGFRex蛋白的表达,用EGF-EGFP蛋白检测其活性。结果成功构建了真核表达载体PLNCX2-EGFRex。以其转染NIH3T3细胞后,经免疫组化和Western blot检测到EGFRex的表达。在荧光显微镜下见细胞膜上有绿色荧光。结论人EGFRex在NIH3T3细胞内以其天然活性形式稳定表达,为抗体制备奠定了基础。

猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达

采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.

狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组基因的表达与鉴定

目的构建狂犬病病毒糖蛋白外膜区基因质粒并在大肠埃希菌中表达,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定基础。方法采用RT-PCR方法扩增狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区基因,目的片段与表达载体PET32a(+)分别经双酶切、胶回收后连接并转化至E.coli BL21(DE3)菌株。阳性重组菌经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析后进行纯化,利用Western blot鉴定其反应原性。结果以狂犬病病毒CTN株为模板扩增的糖蛋白膜外区基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小为1 323bp,与理论值相符;重组质粒经酶切鉴定后转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达的融合蛋白分子质量单位大小约为66.6ku,与理论值相符;重组菌在IPTG终浓度为1mmol/L,诱导时间为4h,温度为37℃时蛋白表达产量最高。该融合蛋白主要以包涵体形式存在,可被His标签抗体识别。结论成功表达了狂犬病病毒糖蛋白膜外区蛋白,该蛋白反应原性良好,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定了基础。

人IL-23R胞外区基因的克隆及蛋白表达研究

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞外区基因,并对其在Escherichia coliBL21(DE3)中的表达进行鉴定分析。方法通过PCR获得hIL-23R胞外区基因片段,将其克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(O)。重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测分析。结果获得全长为990 bp的hIL-23R胞外区基因,以构建的重组质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(O)转化E.coliBL21(DE3)后,SDS-PAGE显示表达蛋白分子质量单位约为64 ku,Westernblot检测该蛋白能被兔抗GST多克隆抗体识别。结论成功构建了hIL-23R胞外区基因的原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R(O),并在E.coli中表达出重组蛋白,为进一步研究hIL-23R的功能奠定了实验基础。

牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pFB-gE转化到杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,制备重组杆粒rBacmid-gE。将该重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9,获得与gE基因发生重组的杆状病毒。Western-blot分析及间接免疫荧光试验(IFA)的结果显示,重组杆状病毒在Sf9中表达了分子质量大小约为43ku的gE融合蛋白,该融合蛋白分别与小鼠抗His标签单克隆抗体和小鼠抗BHV 1多克隆抗体发生特异性结合,表明获得的gE融合蛋白具有良好的免疫反应性。本研究为进一步获得高特异性的诊断抗原奠定了基础。

猪CD8分子α链胞外区基因片段在毕赤酵母中的表达

为了给猪CD8α分子单克隆抗体的研制提供高生物学活性的抗原,采用PCR方法从pGEM-T-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α分子的胞外区基因片段,构建了真核融合表达载体pPIC9K-pCD8α-ED,在毕赤酵母中进行表达,并对重组基因工程菌的发酵时间、pH值进行了优化。结果表明,表达出约20ku的目的蛋白,诱导表达的最适pH值为5.0,诱导表达的最佳时间是120h。Western-blot分析结果显示,表达产物能被鼠抗人CD8α多克隆抗体识别,在20ku左右出现目的条带,说明表达的目的蛋白具有免疫活性结构。

EGFR可溶性胞外段的表达、纯化及鉴定

利用大肠杆菌表达表皮生长因子受体胞外段(ED-EGFR),将目的基因片段插入到p ET28a载体中,将插入目的基因载体转化入BL21表达。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)诱导BL21表达ED-EGFR,破碎后80%的ED-EGFR为可溶性表达,其他则存在包涵体中,将菌液离心上清通过镍柱亲和层析纯化,纯化蛋白样品经过胶浓度为12%SDS-PAGE电泳,条带在相对分子质量58 k左右出现单一条带,并且纯度达到95%以上。通过BCA检测蛋白浓度,利用CCK8方法检测ED-EGFR具有较高活性,人肺非小细胞癌细胞(H1648细胞)增殖明显被抑制,并且在浓度320 ng/m L下抑制效果最好。