组织型转谷氨酰胺酶抑制剂对TGF-β_2诱导人LECs表达纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的影响

目的观察组织型转谷氨酰胺酶(tTG)特异性抑制剂(MDC)对TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞(LECs)表达纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的影响。方法将含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养的LECs株HLE-B3传代后分为5组:无血清培养基培养的HLE-B3为正常对照组;加入10μg/L TGF-β2处理的HLE-B3为TGF-β2组;10μg/L TGF-β2与100、200、400μmol/L MDC共同处理的HLE-B3为不同浓度MDC组。用半定量RT-PCR检测tTG、FN、Col-Ⅳ在HLE-B3中的表达,计算A(tTG/β-actin)、A(FN/β-actin)、A(Col-Ⅳ/β-actin)值。结果正常体外培养的HLE-B3中可表达一定量的tTG、FN及Col-Ⅳ。与正常对照组相比,10μg/L TGF-β2组中tTG、FN、Col-Ⅳ的表达明显增加(t=33.95,P<0.01;t=38.24,P<0.01;t=13.48,P<0.01);与TGF-β2组相比,100、200、400μmol/L MDC组中FN和Col-Ⅳ的表达明显减少(P<0.01)。100、200、400μmol/L MDC组各组间FN和Col-Ⅳ的表达差异均有统计学意义(P<0.01)。结论MDC可剂量依赖性地抑制TGF-β2诱导的LECs中FN、Col-Ⅳ表达的增加。tTG可促进人LECs表达FN、Col-Ⅳ,并参与后囊膜混浊(PCO)的形成。

MMPs抑制剂GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ及Ⅱ对人晶状体上皮细胞移行的抑制作用

背景 白内障术后残留晶状体上皮细胞（LECs）的增生、移行、上皮-间质转化等生物学行为与晶状体后囊膜混浊（PCO）的发生有关,基质金属蛋白酶（MMPs）参与细胞的移行过程.广谱MMPs抑制剂GM6001能抑制人LECs的移行,但特异性MMPs抑制剂,即MMP-2/9抑制剂Ⅰ和Ⅱ对LECs移行能力的影响及药物的安全性尚不明确. 目的 比较GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ对LECs移行的抑制作用及其对细胞活性的影响.方法 对人LECs系进行培养和传代,取传至3～4代的细胞培养于6孔板中,当细胞生长融合至70％后改用无血清培养液作用12h,在培养液中分别加入不同浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00、128.00μmol/L）GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,用200μl无菌枪头在细胞层中划出细胞裸露区,继续培养后24 h计算各组细胞移行的平均距离,计算各种药物对LECs移行的抑制率.在细胞活性的测定中,取传至第2代或第3代LECs,调整细胞密度至5＆#215;105/ml,以200 μl/孔接种至96孔板常规培养,分别加入128.00 μmol/LGM6001、64.00μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用MTT法测定吸光度（A）值,分析并比较3种药物对LECs活性的影响,评估药物对细胞的毒性作用.结果 正常培养的LECs生长良好,贴壁生长的细胞呈梭形或多边形,排列不规则.随着GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ浓度的增加,LECs移行距离逐渐缩短,总体比较差异有统计学意义（GM6001：F=248.647,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅰ：F=357.125,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅱ：F=396.374,P＜0.05）.将对照组细胞移行距离设为1,3种药物浓度为32.00 μmol/L时,GM6001组、MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和MMP-2/9抑制剂Ⅱ组细胞的相对移行距离分别为0.478±0.091、0.294±0.088和0.191±0.081,总体比较差异有统计学意义（F=116.031,P＜0.01）,其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ组中细胞移行距离明显低于GM6001组和MMP-2/9抑制剂Ⅰ组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.对照组、128.00 μmol/L GM6001组、64.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ组的A值分别为0.607±0.016、0.567±0.015、0.583±0.010和0.595±0.014,总体比较差异无统计学意义（F=1.403,P＞0.05）. 结论 3种MMPs抑制剂均可有效抑制体外培养的LECs的移行,且对细胞的生长活性无明显影响,其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ的抑制作用最强。

Wnt3a诱导人晶状体上皮细胞细胞外基质合成和胶原凝胶收缩的机制研究

背景晶状体上皮细胞（LECs）的细胞外基质（ECM）的产生、异常沉积和收缩是PCO发生的重要病理机制。Wnt3a蛋白参与机体组织上皮细胞ECM的产生和纤维化过程，但Wnt3a对晶状体组织中上皮间质转化（EMT）相伴行的ECM的产生和收缩的影响尚不清楚。目的研究Wnt3a对体外培养的人LECsECM合成的影响，并探讨其介导胶原凝胶收缩的相关分子机制。方法用脂质体介导转染技术将Writ3acDNA表达载体瞬时转染人LECs系SRAOI／04细胞作为Wnt3a转染组，对照组转染pcDNA3-HA表达载体。细胞转染后48h，采用Westernblot法测定各组细胞中Wnt3a、ECM主要成分I型胶原纤维（Col-I），Ⅳ型胶原纤维（C01．IV）和整合素B1（integrinp1）的表达；采用免疫荧光法检测α-SMA、细胞纤维状肌动蛋白（F-actin）在胞中的表达和分布。将SRAOI／04细胞与I型胶原凝胶混合，观察胶原收缩情况。结果Wnt3a转染48h，SRAOI／04细胞内Writ3a蛋白相对表达量（相对灰度值）明显升高，对照组细胞和Wnt3a转染组细胞中Wnt3a蛋白表达量分别为0．290±0．066和0．703±0．105，差异有统计学意义（t=5．782，P〈0．01）。Westernblot法检测显示，Wnt3a转染组SRAOI／04细胞中的Col-I和integrinp1蛋白的相对表达量分别为0．697±0．021和0．875±0．055，明显高于对照组的0．370±0．020和0．580±0．030，差异均有统计学意义（t=19．600、8．156，均P〈0．01），Wnt3a转染组Col—IV蛋白相对表达量为0．430±O．020，高于对照组的0．383±0．031，但差异无统计学意义（t=2．514，P〉0．05）。免疫荧光检测显示，对照组细胞中F-actin和α-SMA蛋白主要表达于细胞膜，而Wnt3a转染组细胞中F-aetin和α-SMA蛋白表达于细胞膜、细胞质和细胞核周围，阳性染色程度较对照组明显增强。Col-I凝胶收缩试验结果显示，细胞与Col-I胶原凝胶混合后24h凝胶收缩面积比率明显低于混合后8h（64．1％±2．3％与98．9％±1．0％），Wnt3a转染组凝胶收缩面积比率明显低于对照组（64．1％±2．3％与93．9％±3．1％），差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论Wnt3a过表达可诱导SRA01／04细胞ECM合成和细胞骨架重建，促进细胞收缩。

法舒地尔对转化生长因子-β_2诱导的人晶状体上皮细胞迁移及细胞外基质合成的影响

目的探讨法舒地尔对转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)HLE-B3迁移及细胞外基质合成的影响。方法将培养的HLE-B3分为以下4组:A组:含体积分数10%胎牛血清的完全培养基;B组:含10μg·L-1TGF-β2的完全培养基;C组:含15μmol·L-1法舒地尔的完全培养基;D组:含10μg·L-1TGF-β2+15μmol·L-1法舒地尔的完全培养基。CCK-8法检测不同浓度的法舒地尔对细胞增殖的影响,Transwell小室迁移实验检测各组细胞迁移能力,ELISA法检测各组细胞上清I型胶原(collange-I,COL-I)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达。结果随着法舒地尔干预浓度的增加,对HLE-B3细胞的增殖抑制作用逐渐增强,各浓度组间差异有统计学意义(P=0.000)。随着法舒地尔作用时间延长,对HLE-B3细胞增殖的抑制作用也逐渐增强,各组间差异有统计学意义(P=0.000)。Transwell小室迁移实验显示,48 h时A组、B组、C组、D组细胞穿过聚碳酸酯嵌套膜的个数分别为(29.17±1.17)个、(87.60±5.31)个、(15.60±1.07)个、(44.61±2.06)个,各组间差异有统计学意义(F=111.614,P=0.000);B组较A组、D组较C组迁移细胞明显增多(均为P=0.000);D组较B组、C组较A组迁移细胞明显减少(P=0.000、P=0.003),但D组较A组、B组较C组细胞迁移数量明显增多(P=0.003、P=0.000)。各组细胞上清液中FN、COL-I的含量于12 h开始升高,24 h、36 h时持续升高,48 h时增高明显,各时间点各组间以及组内各时间点间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与A组相比,各时间点B组FN和COL-I蛋白的表达明显增加(均为P<0.05);各时间点D组较B组显著下降(均为P<0.05);但C组与A组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05);D组与A组、C组与B组、C组与D组比较,COL-I、FN差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论法舒地尔可抑制TGF-β2诱导的细胞迁移和细胞外基质的合成,可能在后发性白内障的防治过程中发挥作用。

tTG小干扰RNA对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的抑制作用

目的探讨RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase,tTG)的表达对人转化生长因子β2(transforming growth factor-beta2,TGF-β2)诱导的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)转分化和细胞外基质沉积的抑制作用。方法设计并合成针对tTG的3对小干扰RNA(siRNA):tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-3,用Real-time PCR和Western blot检测转染了siR-NA后HLE-B3细胞表达tTG mRNA和tTG蛋白的变化。然后将体外培养的HLE-B3细胞分为正常对照组、TGF-β2组和TGF-β2+siRNA组。48h后,用Western blot检测各组tTG、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronec-tin,FN)和Ⅳ型胶原(collagenⅣ,Col-Ⅳ)的表达。结果转染tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-348h后,tTG mRNA的表达分别下降为空白对照组的46.60%、12.84%、66.75%(均为P<0.05);tTG蛋白的表达量分别下降为空白对照组的60.49%、27.87%、55.91%(均为P<0.01)。Real-time PCR与Western blot检测结果一致显示了tTG-siRNA-2对tTG基因的抑制效果最佳。与正常对照组相比,TGF-β2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显增加(均为P<0.01);与TGF-β2组相比,TGF-β2+tTG-siRNA-2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显减少(均为P<0.01)。结论靶向tTG的siRNA可以显著降低tTG的表达水平,同时可以明显抑制TGF-β2诱导的HLE-B3细胞合成α-SMA、FN、Col-Ⅳ。提示tTG是介导TGF-β2诱导人LEC转分化和细胞外基质沉积的重要分子。

基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9在后发性白内障形成中的变化

目的：探讨兔眼晶状体皮质吸出术后不同时期MMP-2、MMP-9的变化,推断其在后发性白内障形成过程中的作用.方法：选用中国医科大学实验动物部提供的白色家兔42只,随机分成实验组（35只）及对照组（7只）.实验组肌肉注射氯胺酮15mg/kg进行麻醉,由专人行双眼透明晶状体皮质吸出术.术后1%阿托品眼膏散瞳双眼,分别于术后1周、1、2、3、5个月各处死7只兔;对照组不做处理,直接处死.石蜡标本进行免疫组织化学定位检测MMP-2、MMP-9,冷冻标本用Zymography方法进行MMP-2、MMP-9活性测定.结果：①兔眼后发性白内障形成情况：术后不同时期裂隙灯下观察可见术后前3d前房内炎症反应明显,虹膜充血;术后1周可见前囊截缘出现白色环状混浊,但后囊尚透明;术后2周后囊呈薄纱状;1个月出现线条状混浊,2～3个月成条索状混浊,术后5个月后囊明显混浊.②免疫组化结果：对照组晶体上皮细胞胞浆及细胞间质中没有明显的MMP-2、MMP-9表达,实验组MMP-2于术后1～3个月表达增强.③Zymography凝胶检查：对照组可检测到极低的MMP-2、MMP-9活性（呈淡条带）;实验组MMP-2活性明显强于对照组,MMP-9无明显差异.④活性分析：对照组MMP-2活性为（0.75±0.10）,实验组分别为（3.68±0.12）、（5.18±0.11）、（5.62±0.11）、（6.58±0.11）和（1.19±0.10）;实验组MMP-9活性与对照组相比无显著性差异.结论：正常兔晶体囊膜中有MMP-2、MMP-9活性;术后2～3个月囊膜中MMP-2活性增强;术后2～3个月,囊膜中MMP-9无变化;MMP-2与MMP-9比较,前者与后发性白内障的发病关系更密切.