利用FPLC技术建立重组碱性蛋白酶的快速纯化方案

在构建了以地衣芽孢杆菌为宿主的产碱性蛋白酶的工程菌BA0 71以后 ,为了给探索重组酶的性质及其稳定性奠定基础 ,利用快速蛋白液相层析 (FPLC)技术 ,建立了快速高效纯化碱性蛋白酶的方案。发酵液通过硫酸氨沉淀、DEAE A 5 0脱色及聚乙二醇浓缩得粗酶 ,再经过CM Sephadex C 5 0、Sephadex G 75柱层析后较好地得到了单一组份的重组碱性蛋白酶 ,酶纯度提高了 76.2倍。SDS PAGE显示重组碱性蛋白酶分子质量为 2 8ku。

阳离子交换FPLC二步法制备级纯化单克隆抗体

作者在快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ）建立的二步法制各级纯化单克隆抗体的方法．是将ＭｃＡｂ腹水用ｐＨ６．０，１０ｍｍｏｌ／ＬＰＢ透析或稀释８倍后，直接上ＳＰ－４０ＨＲＦＰＬＣ进行一次纯化，纯化的ＩｇＧ组分再用４０％饱和硫酸铵盐析进行二次纯化和浓缩，即得到ＭｃＡｂ纯品。每次上作量８０～８５ｍｌ腹水，可得到纯化抗体６００～６５０ｍｇ，得率约为７．３ｍｇ／ｍｌ腹水，回收率为７３％，一次色谱纯化周期仅需５０ｍｉｎ．用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法凝胶过滤色谱法和ＤＥＡＥ阴离子交换色谱法检测抗体纯度，一次纯化的ＭｃＡｂ大于９２％，二次纯化的ＭｃＡｂ大于９７％。用免疫组织化学ＡＢＣ测定抗体活性，一次纯化的ＭｃＡｂ为１：８００００（７．８×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ），二次纯化的ＭｃＡｂ为１：１０００００（６．２５×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ）．纯化ＭｃＡｂ的热稳定性好，３７℃保温１４４ｈ后抗体活性无明显变化（Ｐ＞０．０５）；特异性高，与正常组和其它癌组织几乎无交叉反应。该法操作简单，既具有常压色谱的制备量，又具有ＨＰＬＣ法的纯化速度及分辨率，同时又解决了色谱纯化ＭｃＡｂ的浓缩问题，是获得高纯度、高活性ＩｇＧ类单克隆抗体的实用方法．用本方法提纯?

可激活人γδT细胞的结核杆菌耐热多肽抗原的初步纯化与活性鉴定

目的 对结核杆菌耐热多肽抗原（Mtb-Ag）的蛋白组成进行定性分析,并观察Mtb-Ag及其纯化组分刺激人外周血rδT细胞和αβT细胞增殖反应的量效关系。方法 用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）定性分析Mtb-Ag的蛋白组成,并用不同剂量的Mtb-Ag及其纯化组分体外刺激健康人外周血PBMC,培养9d后经流式细胞仪检测细胞表型。结果 Mtb-Ag经FPLC MonoQ离子交换柱分析存在20种蛋白成分。Mtb-Ag在合适刺激剂量时对人rδT细胞发挥优势扩增;当剂量过大则对αβT细胞发挥优势扩增;其分离纯化的含大分子蛋白的蛋白峰I随着刺激剂量增加而对αβT细胞的扩增表现显著增强趋势;而其分离的含低分子多肽的蛋白峰Ⅱ随着刺激剂量增加则对rδT细胞扩增表现显著增强趋势,并且其活性明显高于蛋白峰I,同时其对αβT细胞的扩增效应并不明显,并显著低于Mtb-Ag和蛋白峰I。结论 Mtb-Ag刺激rδT细胞扩增时应选择合适的刺激剂量,其所含的低分子多肽抗原能特异性激活rδT细胞,而其所含的大分子蛋白抗原则特异性激活αβT细胞。

牦牛乳中主要过敏原的分离纯化

为研究牦牛乳蛋白质的过敏性,用化学方法分离牦牛乳中主要的过敏原蛋白质,采用快速蛋白纯化系统(FPLC)结合凝胶层析技术对分离出的蛋白质进行纯化.在牦牛脱脂乳中添加10%醋酸至酪蛋白的等电点pH4.6,使酪蛋白和乳清蛋白分离.根据酪蛋白在尿素溶液中的溶解度和对钙的敏感性不同,对酪蛋白进行粗分级,得到αs-酪蛋白和β-酪蛋白.应用离子交换色谱和葡聚凝胶sephadex G100进一步纯化粗分级得到的酪蛋白,得到αs-casein和β-酪蛋白.以柠檬酸钠为螯合剂、在低pH并有盐存在的条件下从酸乳清中分离出β-乳球蛋白,FPLC纯化后用RP-HPLC检测其纯度,得到αs-casein和β-酪蛋白纯度分别为87.13%和88.58%,β-乳球蛋白的纯度为80.00%.

毛细管电泳法检测结核杆菌蛋白多肽类抗原活性成分研究

采用毛细管电泳法分离检测结核杆菌耐热抗原样品中的活性成分。熔融石英毛细管55cm(40cm处检测窗口)×50μm i.d.;缓冲液:0.15mol·L-1硼酸盐(含5g·L-1PEG-4000,pH=10.92);分离电压:+12 kV;进样压力:0.5 psi(3.45 kPa),进样时间3.0s;分离温度:25℃;UV-Vis检测器检测波长:200nm。本方法能分离溶菌酶标准蛋白和牛血清白蛋白标准品,根据分子量大小能有效分离结核杆菌耐热抗原样品活性成分,线性回归方程相关系数r2在0.99673以上,定量限在19.47μg·mL-1左右。样品加标回收率在96.09%左右,相对标准偏差小于8.13%,本方法与快速蛋白液相色谱法结果一致。该方法简便、灵敏、快速、可靠、重现性好,能用于结核杆菌耐热抗原样品中活性成分测定。

水稻白叶枯病菌解毒素蛋白提纯和作用机制研究

采用 (NH4) 2 SO4分步沉淀法 ,从水稻白叶枯病菌培养滤液中提取对水稻白叶枯病菌有机酸毒素具解毒作用的解毒蛋白粗提物 (crudedetoxificationprotein ,CDP) ,经滚动式等电聚焦电泳 (RPIE)和离子交换层析 (FPLC)分离 ,生物测定结果表明 ,第Ⅱ吸收峰具有生物活性 ;再经SDS PAGE电泳和考马斯亮蓝染色 ,第Ⅱ吸收峰收集物有明显的一条带 ,相对分子质量为 4 7 9× 10 3 。野生菌产生的CDP解毒活性明显低于其毒性基因突变体。CDP对热和蛋白酶K均不稳定 ,对毒素的解毒主要是通过脱羧起作用。用CDP处理水稻后 ,水稻体内与抗病性相关的酶活性显著提高 ;接种水稻白叶枯病菌 。

快速蛋白液相色谱系统纯化肺癌组织热休克蛋白70及其鉴定

目的:从肺癌组织中纯化并鉴定热休克蛋白70(HSP70),为研究其免疫原性和作为肿瘤疫苗奠定基础。方法:用组织蛋白裂解液从肺癌组织中提取总蛋白,应用ConA-sepharose亲和层析和快速蛋白液相色谱系统(FR-LC)连续分离、梯度洗脱获得蛋白,应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot进行蛋白相对分子质量及免疫原性鉴定。结果与结论:所获蛋白的相对分子质量为70000,经Western-blot鉴定为HSP70。

唐菖蒲球茎中抗真菌物质的部分性质研究

本文报道唐菖蒲球茎中抗真菌活性物质的成分及其分子量测定方法和结果。用沸水提取，经过超滤、透析、柱层析，纯化到一种有抗真菌活性的物质。排除了它是蛋白质、核酸、脂类及小分子物质的可能性，确定这是一种多糖，定名为唐菖蒲抗真菌多糖（Gladiolus hntifungal Polysaccharide，简称GAFS）。真空旋转蒸发干燥后，用苯酚-硫酸法测得干燥后的样品糖含量为44．08％，用FPLC（快速蛋白质液相层析仪）测其分子量为15750。

快速蛋白液相色谱系统纯化和分析小鼠肝癌细胞热休克蛋白70的研究

目的 :应用快速蛋白液相色谱 (FRLC)系统建立分离和纯化 615系小鼠肝癌细胞系Hcaf细胞膜上热休克蛋白 (HSP70 )的分离方法。方法 :用经 4 3℃热处理 8h的Hcaf细胞制备裂解液 ,用ConA Sepharose 4B和MonoQ柱进行连续分离 ,所得蛋白经电泳及Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定。结果 :纯化蛋白经鉴定为分子量70 0 0 0的HSP70。结论 :用此层析法经FRLP可分离纯度较高的HSP70。

酸化沉淀蛋白-超快速液相色谱-串联质谱法测定肝损伤大鼠血浆中的头孢呋辛

为了研究二代头孢类新药头孢呋辛赖氨酸在肝损伤大鼠体内的药代动力学过程,建立了采用超快速液相色谱-串联质谱(UFLC-MS/MS)快速测定肝损伤模型大鼠血浆中头孢呋辛含量的方法。血浆样品在酸性条件下用乙腈沉淀蛋白,采用Shim-pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm,2.2μm)为分析柱、乙腈-0.1%甲酸水溶液(40∶60,v/v)为流动相、流速为400μL/min进行色谱分离,采用电喷雾负离子(ESI-)模式电离、多反应监测(MRM)模式进行质谱检测,用于定量分析的离子对分别为m/z 423.2→206.8(头孢呋辛)和m/z 454.1→238.4(内标头孢噻肟)。结果表明,大鼠血浆中头孢呋辛的质量浓度在0.01～1 mg/L和1～400 mg/L范围内线性关系良好(r>0.99),定量限为0.01 mg/L,日内和日间精密度(以相对标准偏差(RSD)计)均小于11.5%,准确度(RE)为-7.1%～2.2%,平均萃取回收率大于83.5%,样品运行时间仅为3.0 min,能够满足生物样品的测定需求。该法简便、快速,已用于肝损伤大鼠静脉注射头孢呋辛赖氨酸的药代动力学预实验研究。

天麻糖蛋白GGE2b的分离纯化及对急性血瘀大鼠血液流变的影响

目的:从天麻中分离纯化得到糖蛋白组分GGE2b,研究其对急性血瘀大鼠血液流变学指标的影响。方法:采用离子交换和快速蛋白液相层析色谱(FPLC)技术分离天麻水溶性提取物,得到组分GGE2b。采用皮下注射盐酸肾上腺素结合冷刺激的方法制造急性血瘀大鼠模型。观察GGE2b各剂量组对急性血瘀大鼠全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数和红细胞变形指数的影响。结果:离子交换结合FPLC技术分离纯化得到天麻糖蛋白组分GGE2b。GGE2b60、120mg/kg能够显著降低急性血瘀模型大鼠高切、中切的全血黏度(P<0.05或0.01)和血浆黏度(P<0.01),降低红细胞聚集指数(P<0.05或0.01),增大红细胞变形指数(P<0.05)。结论:层析技术用于天麻糖复和物的分离纯化是可行的,且得到的糖蛋白组分GGE2b对急性血瘀大鼠异常的血液流变有良好的治疗效果。

一种实用高效的高纯氮气制备装置的介绍

着重介绍了用催化剂制备高纯氮气的新型装置，该装置可使普通氮气中氧的含量降到 ５×１０－ ６ 以下。

约氏疟原虫保护性抗原快速蛋白液相色谱法纯化及鉴定

目的：建立制备级纯化约氏疟原虫（Ｐ．ｙ．）保护性抗原的新方法。方法：应用快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ），将重度感染Ｐ．ｙ．的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠血液中提取的粗抗原，首先用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶色谱柱进行分离，收集活性组分，再用ＤＥＡＥ－４０ＨＲ阴离子交换色谱柱进一步纯化。结果：一次上样量约２００ｍｇ，可得到纯化抗原１４ｍｇ。经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）测定抗原纯度＞９０％，抗原分子量为５３ｋＤａ。结论：动物实验证明，该抗原具有很好的保护作用。该法操作比亲和色谱法简单，制备量大于亲和色谱法和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ），纯化效率和纯度与ＨＰＬＣ法相似，一次纯化周期仅需３ｈ，是Ｐ．ｙ．抗原纯化的高效方法。

快速蛋白质液相色谱法分离鉴定脱氧寡核苷酸片段

由机器合成的反义核酸药物需要有效的纯度鉴定方法。用 Ｍ Ｏ Ｎ Ｏ Ｑ 柱在 ｐ Ｈ １２ 时以 Ｎａ Ｃｌ的浓度梯度洗脱，可将 １９ 至 ２１ Ｎｔｓ 的小片段寡核苷酸很好分开。

用快速高效液相色谱系统分离纯化Gc蛋白

报告Gc蛋白的一种分离方法，为免疫制备抗Gc血清制备抗原。硫酸该分级沉淀出含Gc的人血清组份，BlueSepharoseCL－6B亲和色谱除去含Gc硫酸铸分级沉淀的人血清组份中的白蛋白，快速高效液相色谱系统过Alkyl-SuperoseTMHR5／5疏水色谱柱和MonoQHR5／5离子交换柱。聚丙烯酸胺凝胶解离、非解离电泳证明，Gc蛋白得到了彻底纯化。免疫固定显示：纯化出的蛋白确实是Gc蛋白．为1-1型。快速高效液相色谱为蛋白质的纯化提供了新的技术及仪器手段。

抗人同种异型G1m(3)单克隆抗体研制及特异性鉴定

用快速液相色谱仪从G1m（3）阳性人血浆中纯化IgG1蛋白，用其免疫BALB／C／小鼠．建立了一株分泌抗人G1m（3）单克隆抗体的细胞株（D7E8）。经抑制ELISA，直接ELISA及斑点ELISA分析，证明D7E8抗体具有G1m（3）单一特异性。其培养上清液效价为512倍，并初步应用于法医办案。

人肺癌组织中热休克蛋白70(HSP70)的纯化

用快速蛋白液相色谱系统并结合ConA-Sepharose柱,建立了从人肺癌组织中分离纯化热休克蛋白70(HSP70)的方法,分离得到的蛋白经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法鉴定,结果表明该蛋白为HSP70;并且通过Brad-ford标准曲线法对蛋白进行定量,计算出HSP70的得率为:每克湿重肺癌组织可纯化得到约53.2μg HSP70。

KANSL1蛋白的真核表达纯化及功能验证

目的利用昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)表达KANSL1蛋白并进行纯化,同时验证该蛋白在体外对微管蛋白聚合的影响。方法构建真核表达载体pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒(Bacmid),用脂质体转染介导Bacmid进入草地贪夜蛾细胞(Sf9 cell),以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。随后用此重组杆状病毒感染并扩增Sf9细胞使其大量表达His-mCherry-KANSL1融合蛋白。通过镍柱亲和层析对表达的His-mCherry-KANSL1融合蛋白进行初步纯化,再经快速蛋白液相色谱(FPLC)进一步纯化,利用Western印迹、考马斯亮蓝染色鉴定目的蛋白的表达纯化效果,最后通过体外微管聚合实验分析纯化的KANSL1蛋白对微管蛋白聚合的影响。结果质粒测序显示,pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒构建成功;考马斯亮蓝染色、Western印迹表明纯化得到正确的His-mCherry-KANSL1蛋白,体外微管聚合实验显示KANSL1蛋白显著促进微管蛋白的聚合。结论成功构建pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒并在真核表达系统中表达和纯化,重组KANSL1蛋白具有促进微管聚合的作用,为后续KANSL1蛋白功能研究奠定了基础。