鸡致病性大肠杆菌1型菌毛fimI基因克隆与序列测定

对鸡O2血清型致病性大肠杆菌1型菌毛fimI基因进行了扩增并与国外同源菌株基因序列进行了比较。结果表明:两者核苷酸同源性达98.42%,预测氨基酸顺序同源性达98.92%。fimI基因的预测氨基酸序列中仅第46位氨基酸由ALA变为THR,第76位氨基酸由SER变为ALA,其余核苷酸的变化未影响氨基酸的翻译。推测,这种改变是由分离株的差异所引起的。

单核细胞增生李斯特氏菌PCR-DHPLC检测新技术的建立

应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌fimY的快速检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌prfA和hlyA基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以单核细胞增生李斯特氏菌等61株参考菌株做特异性试验;单核细胞增生李斯特氏菌菌株稀释成不同梯度,进行灵敏度试验。试验结果表明该方法具有很好的特异性,灵敏度较高,检测低限可达到为181CFU/ml。可以快速、准确检测单核细胞增生李斯特氏菌,是食品中致病菌快速检测的新技术。

动物性食品中沙门菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据沙门菌属高度保守的fimY基因序列设计探针和引物,通过优化反应条件,建立检测动物性食品中沙门菌实时荧光定量PCR方法,应用于动物性食品中沙门菌的快速检验。建立的荧光PCR方法灵敏度约为5.2cfu/mL,经对781份肉类、蛋、奶及水产品进行检测,共检出56份阳性样本,与国标(GB/T4789.4——2008)方法的检测结果一致。建立的荧光PCR方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。

沙门氏菌fimY基因的原核表达及禽沙门氏菌抗体检测ELISA研究

为研发禽沙门氏菌抗体检测方法,采用大肠杆菌系统表达沙门氏菌属保守的菌毛fimY基因,纯化的目的蛋白经Western blot分析,能与免疫鸡血清和感染鸡血清产生特异性反应条带,证明该重组蛋白既有反应原性也有免疫原性。以此纯化蛋白为抗原建立了间接ELISA(fimY-ELISA)。通过检验已知沙门氏菌鸡源血清、相关非沙门氏菌鸡源血清对fimY-ELISA进行评价,发现其在敏感性方面高于快速平板凝集试验(RPA)和自制的脂多糖抗原ELISA(LPS-ELISA)、肠炎沙门氏菌抗原ELISA(SE-ELISA),但在特异性方面不如LPS抗原ELISA;在与RPA的符合率方面与LPS-ELISA、SE-ELISA基本一致。

马流产沙门菌fimY基因同源性分析及蛋白表达

为对马群中沙门菌进行快速、准确检测,根据GenBank公布的沙门菌菌毛蛋白fimY基因为模板设计一对特异性引物,用PCR方法扩增fimY部分基因。将fimY目的基因亚克隆至PGEX-4T-2原核表达载体,转入BL21(DE3)感受态细胞后用IPTG进行诱导表达,并对目的蛋白进行反应性检测。结果表明,克隆fimY基因大小为490bp;成功构建fimY原核表达载体PGEX-fimY,经SDS-PAGE显示带有GST标签的目的蛋白大小为47ku,与预期相符;Western blot证明,目的蛋白fimY能够结合沙门菌标准阳性血清,为建立马流产沙门菌间接ELISA检测方法奠定了基础。

食品中沙门菌变性高效液相色谱检测技术的研究与方法建立

目的:应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中沙门菌的快速检测方法。方法:根据沙门菌fimY基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以沙门菌等89株参考菌株做特异性检测;沙门菌液体培养物稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:试验结果表明该方法有很好的特异性,而其它非沙门菌均为阴性。该方法灵敏度较高,检测低限可达到45 cfu/ml。结论:该方法可以快速、准确检测食品中沙门菌,是食品中致病菌检测的新技术和新方法。

双重PCR检测肠炎沙门氏菌方法的建立

沙门氏菌是引起人类食物中毒事件的主要病原之一,其中,肠炎沙门氏菌因其可感染家禽、污染禽蛋而受到广泛关注。本试验根据沙门氏菌属特异性基因片段fimY和肠炎沙门氏菌特异性基因片段sdfI分别设计一对引物,对25株沙门氏菌和大肠杆菌进行双重PCR扩增,结果显示22株沙门氏菌均出现与理论值大小497bp相符的属特异性条带,作为对照的3株大肠杆菌则未显示该条带,并且7株肠炎沙门氏菌均出现与理论值大小293bp相符的特异性条带。另外,敏感性试验结果显示肠炎沙门氏菌50336和鸡白痢沙门氏菌SP1的模板浓度分别为18ng和15ng时仍能清晰扩增出特异性条带。上述结果表明建立的PCR方法具有快速简便、灵敏性高、特异性强等特点,为公共卫生、食品安全、畜牧兽医及出入境安检等多部门检测和监测沙门氏菌提供了前提基础和技术保障。

粪肥纤维单胞菌木质素 11A基因野生型与点突变子底物结合特性研究(英文)

本文报道 ,应用点突变技术获得的粪肥纤维单胞菌 (Cellulomonasfimi)木质素酶 11A(Xyn11A)基因的3个点突变子 ,即R2 62G ,R573G和R2 62G R573G ,表达产物结合底物特性的测定结果。试验表明 ,R2 62G R573GXyn11A与野生型Xyn11A基因表达产物结合底物的特性明显不同 ,表现为前者不与木质素结合而与纤维素结合 ,后者与纤维素和木质素均结合 ,但与木质素结合能力更强 ,与野生型Xyn11A一样 ,R2 62GXYN11A和R573GXyn11A也能与纤维素和木质素两者结合 ,但与纤维素的结合力更强 ,而与木质素结合力弱。用纤维素作为底物测定Xyn11A和R2 62G ,R573G和R2 62G R573GXyn11A的Kr值分别为 0 .6,1.1,1.1和 1.9L g。

Taqman MGB PCR定量检测水产品中沙门氏菌的方法建立

建立采用Taqman MGB实时荧光PCR法快速定量检测水产品中沙门氏菌。根据沙门氏菌fimY基因保守序列,设计引物和Taqman MGB探针,建立Taqman MGB实时PCR定量检测体系。采用本方法对24株共14种血清型沙门氏菌和17株与沙门氏菌亲缘关系比较近,以及在样品中能同时存在的常见食源性致病菌菌株进行PCR扩增。结果显示:所有的沙门氏菌菌株结果均为阳性,而非沙门氏菌菌株检测结果均为阴性,反应特异性为100%。本方法的纯菌最低检测低限为13CFU/ml,样品江瑶贝和蚬子肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为130CFU/ml;香螺肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为1300CFU/ml。定量关系式为y=-3.381418lnx+45.115715,R2=0.964878。整个实验2h即可完成,可应用于水产品中沙门氏菌污染状况调查及快速检测。

建立基于fimY基因的LAMP技术检测食源性沙门菌

沙门菌是人类一种常见的食源性致病菌,沙门菌主要污染肉类、鱼、禽、奶、蛋等食品。食用了这些未煮透的污染食品是引起沙门菌食物中毒的最主要原因。研制能对食品中的沙门菌进行现场快速精准检测的试剂盒,对于保障人们的食品安全具有重要意义。本研究以沙门菌的fimY基因作为特异性的检测靶基因,建立一种可视化、低成本的环介导等温扩增技术,以快速检测食源性沙门菌。建立的LAMP方法具有良好的特异性,对肠出血性大肠杆菌O157、肠毒性大肠杆菌ETEC、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等其他食源性致病菌和空白对照(水)的检测结果均为阴性。灵敏性检测结果表明,建立的LAMP检测沙门菌的灵敏度为3.8×10^(1)CFU/mL,而常规PCR检测沙门菌的灵敏度为3.8×10^(4)CFU/mL,LAMP法检测比常规PCR检测的灵敏度高1000倍。另外,采用建立的LAMP方法对18株鸡源和猪源的沙门菌分离株进行检测,结果均为阳性,与基于invA基因的常规PCR结果的一致。本研究中建立的LAMP检测方法为食源性沙门菌的检测提供一种可视化、灵敏、成本低的快速检测技术。

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

目的将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×102cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2 cfu/25 g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。

食品中沙门氏菌DNA环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据沙门氏菌属高度保守的fimY基因序列设计了2对特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立了食品中沙门氏菌的LAMP快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对40种共68株细菌进行扩增,所试32株沙门氏菌均为LAMP阳性,其他菌株为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的沙门氏菌的检测灵敏度为5CFU/管,对污染食品中沙门氏菌的检测灵敏度为9CFU/管,60min内即可完成检测。用建立的LAMP方法对802份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出165份LAMP阳性样本,与国标(GB/T4789.4-2008)方法的检测结果一致。建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。

沙门菌LAMP检测方法的建立

建立了一种沙门菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列,利用Primer Explorer V5软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法,并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明,针对fimY基因建立的LAMP方法具有较强的特异性,最低可检出浓度为56×102CFU/mL,灵敏度高于PCR方法 10倍。