肠炎沙门菌菌毛重组蛋白对其细胞黏附的竞争性阻断效应

鸡沙门菌通过其菌毛、鞭毛黏附宿主小肠上皮细胞是其致病过程不可或缺的重要环节。本研究旨在分析原核表达的菌毛重组蛋白FimA-sefA对肠炎沙门菌黏附小肠上皮细胞(IPEC-J2)竞争性阻断效应。将FimA、sefA基因片段克隆至pET28a(+),构建重组质粒pET28a-FimA-sefA,转化至菌株BL21(DE3)经镍柱亲和层析法(Ni-NTA)纯化获得重组蛋白FimA-sefA;利用间接免疫荧光法(IFA)、平板计数法分析肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附。结果显示:表达的重组蛋白FimA-sefA分子量为36 ku;重组蛋白FimA-sefA、重组菌及肠炎沙门菌均能黏附IPEC-J2细胞;重组蛋白FimA-sefA及重组菌均能竞争性阻断肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附,重组菌的阻断效应强于重组蛋白。因此,我们认为重组蛋白FimA-sefA能够在一定程度上竞争性阻断肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附,为预防及减轻肠炎沙门菌感染策略提供了新的思路。

双价工程菌K_(88)K_(99)表达蛋白提取方法的探讨及抗原性分析

本研究应用酸脱毛法 ,将供试工程菌培养物进行脱毛、提取制备表达蛋白 ,并对酸脱毛法的最适pH值、最佳温度、最佳时间进行了探讨 ,SDS_PAGE分析结果证明 ,酸脱毛法脱毛pH值为 2、脱毛温度为 6 0℃、脱毛时间为 30分钟时 ,表达蛋白分离提取的效果最佳。对提取蛋白进行琼扩 ,SDS_PAGE、Western_blot分析 ,结果表明所提取蛋白具有较高的抗原活性 ,并能被K88K99单克隆抗体所识别。

PEBP在切割穹窿海马伞大鼠海马中的表达变化

切割大鼠右侧穹窿海马伞,应用Western blot、免疫组化技术,观察切割后海马中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyle-thanolamine binding protein,PEBP)的表达的时空变化。Western blot结果显示:PEBP在切割后3 d表达开始上升,7 d达最高水平,随后缓慢下降,28 d时降至正常。免疫组化结果显示:术后各时间点切割侧海马CA1～CA3区的锥体细胞层和齿状回颗粒层的PEBP阳性细胞数与正常侧相比无显著性差异(P>0.05),但切割侧PEBP阳性细胞染色加深,7 d时最为明显,两侧比较灰度值有显著性差异(P<0.01)。切割侧齿状回门区和颗粒下层中可见较多深染的PEBP阳性细胞,其细胞数和灰度值与正常侧相比均有显著性差异(P<0.05)。结合本课题组以往的工作,本结果提示切割穹窿海马伞后PEBP的高表达可能与海马神经再生有关。

口腔细菌黏附机制的研究进展

口腔细菌黏附的机制是口腔微生物学和生态学的研究热点之一,近年来,随着分子生物研究水平的提高,口腔细菌黏附机制的研究在分子水平上有了较大的进展。细菌表面的黏附蛋白和受体以及菌毛和胞外多糖都参与细菌间的共聚及细菌对牙表面的黏附。材料表面的获得性薄膜、粗糙度、表面电荷和疏水性等特性也能影响细菌的定植和黏附。本文就细菌和材料两个方面对口腔细菌黏附的机制及控制细菌黏附的方法作一综述。

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因的克隆及表达纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因并使其在大肠杆菌中正确表达。方法利用PCR方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建其原核表达质粒pT-BAD/fimA,获得其在大肠杆菌中的表达,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定重组蛋白。以不同质量浓度咪唑缓冲液(250、200、150、100、50μmol·L-1)洗脱结合在His-tag纯化柱的目的蛋白,选择最佳洗脱质量浓度。结果克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;诱导表达后可观察到相对分子量3.8×104的融合蛋白,经MALDI-TOF-MS检测进一步证实为FimA蛋白。100μmol·L-1咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度最高,其纯度为95%。结论本实验成功克隆了fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到纯度较高的FimA蛋白,为后续研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒奠定了基础。

嗜酸乳杆菌细胞壁提取物对致病性大肠杆菌粘附鸡肠纹状缘膜的影响

为研究嗜酸乳杆菌细胞壁提取物对致病性大肠杆菌(E.coli)粘附鸡肠纹状缘膜的影响,本实验以雏鸡小肠纹状缘膜为模型,以嗜酸乳杆菌和鸡致病性E.coli O78为研究对象,提取嗜酸乳杆菌表层蛋白、肽聚糖及E.coli O78菌毛,雏鸡小肠纹状缘膜,采用固相粘附试验和生物素标记法从分子间相互作用的关系评价了嗜酸乳杆菌细胞壁提取物对菌毛粘附的抑制作用,结果表明:表层蛋白和肽聚糖对菌毛粘附具有明显的抑制作用,呈浓度依赖性抑制菌毛与纹状缘膜的结合,具有竞争性拮抗作用,这主要是由空间占位造成的。肽聚糖的抑制作用相对较小。

粘性放线菌对牙面粘附机理的研究Ⅳ.粘性放线菌唾液蛋白受体的研究

采用 3H-标记的粘性放线菌不同菌株 ,对 7种唾液蛋白包被羟基磷灰石的粘附实验 ,来筛选菌毛 及菌毛 的唾液蛋白受体。结果发现 :富脯糖蛋白 (PRPG)、酸性富脯蛋白及富酪蛋白是粘性放线菌菌毛 的受体 ;PRPG、SIg A是菌毛 的受体 ;PRPG是两种菌毛共同的受体 ;同时还发现不同唾液蛋白成份对不同的菌株粘附影响有差异 ,新分离的粘性放线菌菌株的粘附能力比参考株强。

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白的重组及表达

目的克隆Ⅱfi m A型牙龈卟啉单胞菌菌毛fi m A基因并使其在结肠埃希菌中正确表达。方法利用聚合酶链反应技术克隆Ⅱ型fi m A基因,经酶切和测序验证后构建原核表达质粒p ET-Fim A,使其在结肠埃希菌中表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定表达产物。结果克隆基因测序结果与Gene Bank数据库中的序列呈现95%同源性,成功构建fi m A基因原核表达载体p ET-Fim A。结论高效表达出Ⅱfi m A型重组菌毛蛋白,并获得较高纯度,且具有免疫原性和免疫反应性。

切割海马伞海马中56kD差异蛋白的质谱分析

目的:探讨切割海马伞海马中具有生物活性的56kD差异蛋白的组成成份及其功能。方法:切割SD大鼠海马伞后14d海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE),应用电喷雾质谱分析、蛋白质数据库和文献分析等方法对56kD差异蛋白进行检测和功能分析。结果:质谱分析找到了33组肽段,这些蛋白按照其功能可以分为:细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、核酸水解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知蛋白。结论:切割海马伞海马中56kD差异蛋白中含有功能涉及神经干细胞迁移、分化的蛋白质。

切割海马伞大鼠海马中65kD和83kD差异蛋白诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用

目的：探讨切割海马伞大鼠海马中65 kD、83 kD差异蛋白是否具有诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。方法：切割海马伞后的海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,将65 kD、83 kD差异蛋白胶条与大鼠神经干细胞球共培养,计数神经球朝胶条方向1/4扇区内迁移出的细胞数。10 d后行微管相关蛋白2(MAP-2)免疫荧光,计数其中MAP-2阳性神经元数,图像处理其胞体面积和细胞周长。结果：83 kD切割组朝胶条方向迁移的细胞最多,迁移速度最快。其分化的神经元数量多,胞体大、周长长,明显地优于83 kD正常组、65 kD切割组、65 kD正常组和空白对照组。结论：大鼠海马组织中83 kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。

NOV蛋白在切割海马伞大鼠海马中表达的变化

通过切割右侧海马伞制备大鼠海马伞损伤模型,应用Westernblotting、免疫组织化学技术,观察切割海马伞后不同时程海马中肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)蛋白表达的变化,并对结果进行图像处理和统计学分析。Westernblotting结果显示,NOV蛋白在切割海马伞后3d表达开始上升,14d达高峰后缓慢下降。切割海马伞后14d切割侧和正常侧相比较,海马CA1-CA3区的锥体细胞层及齿状回颗粒层NOV阳性细胞数目无显著性差异(P>0.05),但切割侧NOV阳性细胞明显比正常侧深染,两侧比较平均灰度值有显著性差异(P<0.01)。结合本课题组以往的工作,本研究结果提示,切割海马伞后海马中高表达的NOV蛋白可能参与了诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的过程。

动物源性粪肠球菌Ebp菌毛亚单位蛋白多抗的制备及其对生物被膜形成的影响

目的研究制备动物源粪肠球菌Ebp菌毛亚单位蛋白多克隆抗体及其可能的免疫学作用。方法运用生物信息学软件对粪肠球菌菌毛EbpA、EbpB和EbpC蛋白的抗原表位进行预测,发现6个抗原表位,将其构建重组质粒,表达、纯化,免疫新西兰大白兔后获得了6个菌毛亚单位多克隆抗体,再进行抗体特异性和生物膜阻断分析。结果6个菌毛亚单位重组蛋白与预测的分子量相符,均对新西兰大白兔具有免疫原性,EbpA1、EbpA2、EbpA3、EbpB1、EbpC1和EbpC2亚单位蛋白多克隆抗体效价经双向免疫琼脂扩散实验检测分别达到1∶16、1∶8、1∶32、1∶32、1∶64和1∶64。经WB检测和生物膜阻断试验,6个多克隆抗体均具有抗原特异性和野生菌株生物膜阻断作用,而且以EbpA1、EbpC1和EbpA3的生物膜阻断作用最强。结论粪肠球菌EbpA1、EbpC1和EbpA3亚单位蛋白可能为粪肠球菌免疫预防和治疗奠定基础。

切割穹隆海马伞后大鼠海马中83ku差异蛋白的质谱分析

目的:探讨切割穹隆海马伞海马中具有诱导神经干细胞向神经元分化生物活性的83 ku差异蛋白的组成成分及其功能。方法:切割SD大鼠穹隆海马伞后14 d海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),应用电喷雾质谱分析、蛋白质数据库和文献分析等方法对83 ku差异蛋白进行检测和功能分析。结果:质谱分析找到了17组肽段,这些蛋白按照其功能可以分为:细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知蛋白。结论:切割穹隆海马伞海马83 ku差异蛋白可以通过参与Rho信号通路,调控神经干细胞向神经元分化。

原位杂交法检测切割穹窿海马伞大鼠海马中PEBP mRNA的表达

目的:探讨切割穹窿海马伞侧大鼠海马与正常侧海马中PEBP mRNA的表达差异。方法:取6只大鼠,于切割右侧穹窿海马伞后第7d,应用寡核苷酸探针原位杂交技术观察PEBP mRNA在切割侧和正常侧海马中的表达差异。结果:切割侧锥体细胞层和齿状回颗粒层PEBP mRNA阳性细胞数量与正常侧比较无明显差异(P>0.05),但切割侧的杂交信号强于正常侧(P<0.05);而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧PEBP mRNA阳性细胞数量多于正常侧,杂交信号也强于正常侧(P<0.05)。结论:结合本课题组以往的工作,切割穹窿海马伞后海马内PEBP mRNA的表达上调,可能与海马内神经干细胞向胆碱能神经元的分化有关。

CS3菌毛可以作为异源抗原决定簇的嵌合表达载体

CS3是肠毒素源性大肠杆菌的菌毛蛋白,是一种很强的免疫原。研究了利用CS3菌毛作为异源抗原决定簇载体的可能性。在计算机分析预测CS3亚基的抗原表位区、二级结构的基础上,运用PCR定点突变在CS3亚基结构基因中引入了SacⅡ酶切位点序列,插入编码霍乱毒素B亚基抗原表位CTP3的DNA序列,构建了表达CS3/CTP3的重组菌株。电镜和免疫电镜观察证明,CS3/CTP3以杂合菌毛的形式存在于菌体表面,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了CS3/CTP3杂合蛋白的存在。口服和腹腔注射免疫Bal b/c小鼠,该重组菌株可诱发抗CS3和抗CTP3的双重免疫应答。结果表明CS3可以作为表达异源抗原决定簇的表达载体,可望成为研制口服粘膜免疫多价疫苗的新型系统。

1株鸡源神经型大肠埃希氏菌的分离及特性分析

从某鸡声以瘫痪、歪颈、昏睡为主要症状的肉雏鸡脑实质中，分离到１株革兰氏阴性、有动力的短杆菌，定名为ＬＣＢ。其主要生化特性为氧化酶阴性、接触酶阳性，发酵葡萄糖、甘露醇，产酸产气，了酵乳糖、山梨醇，不发酵蔗糖、卫茅醇、肌醇，不产生硫化氯，不液化明胶，不分解尿素，Ｍ－Ｒ阳性，Ｖ－Ｐ阴性。经鉴定为大肠埃希氏菌，血清型属Ｏ１３１，为国内外新发现的鸡大肠埃希氏菌的血清型。该菌株腹腔接种对ＫＭ小鼠具有高致病性，

阿尔茨海默病大鼠海马细胞外调节蛋白激酶的变化

目的 :探讨细胞外调节蛋白激酶 (ERK)与阿尔茨海默病 (AD)发病机制的关系。方法 :应用穹窿海马伞切断AD大鼠模型 ,分别用同位素方法和蛋白质印迹检测ERK的水平。结果 :同位素方法检测穹窿海马伞切断AD大鼠海马ERK的活性 ,发现手术组手术侧为 (13.4 6± 3.2 3) pmol·mg-1·min-1,明显高于正常对照组 (10 .80± 1.5 0 )pmol·mg-1·min-1、假手术组 (10 .74± 1.6 2 )pmol·mg-1·min-1和手术组非手术侧 (10 .79± 2 .2 3)pmol·mg-1·min-1;Westernblot显示ERK水平在手术组高于正常对照组。结论 :穹窿海马伞切断AD大鼠海马ERK升高 ,说明ERK信号转导途径在AD发病早期有改变。

海马放射状胶质细胞体外诱导激活后PEBP蛋白的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞的侧海马提取液对放射状胶质细胞中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)表达的影响。方法:将培养的海马放射状胶质细胞接种于培养板中,分成对照组和诱导组,对照组中加入含5%正常海马提取液的DMEM/F12细胞培养液,诱导组中加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液。培养7 d后,通过免疫荧光标记法观察PEBP在放射状胶质细胞中的表达,并提取总蛋白,采用Western blot的方法观察对照组及诱导组中PEBP蛋白的表达变化。结果:PEBP蛋白在放射状胶质细胞中能够表达,诱导组的表达比对照组明显增加(P<0.05)。结论:PEBP的表达增加可能与切割侧海马提取液"激活"的放射状胶质细胞向神经元分化有关。

大肠杆菌K88菌毛蛋白发酵工艺的初步研究

采用液体培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和强化营养肉汤培养基对大肠杆菌K88进行发酵培养,采用不同摇瓶培养时间和不同pH值的培养基观察发酵结果,研究菌体和菌毛生产量的相关性,并通过紫外分光光度计UV751于600nm处测量菌体OD值以对菌种发酵情况进行检测.热激分离菌体和菌毛蛋白,(NH4)2SO4盐析分离纯化K88菌毛蛋白并用分光光度计于280nm处测定其OD值.透析后经SDSP-AGE检测菌毛蛋白纯度.根据实验结果优化发酵培养条件,确定菌种的最佳发酵工艺,以收获最多的K88菌毛蛋白.经过实验研究,最终确定了大肠杆菌K88在pH值为6.5、转速为250r/min的条件下发酵18个h,菌体和菌毛生产量均达到高峰,同时得出菌毛蛋白和菌体成正相关.

磷酸化细胞外信号调节激酶在海马提取液诱导神经干细胞向神经元分化过程中的表达

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路在海马提取液诱导神经干细胞向神经元分化过程中的作用。方法切割12只SD大鼠右侧穹隆海马伞,14d后分别取切割侧和正常侧海马制成匀浆,离心收集上清液,蛋白定量后备用。将获取的鼠胚海马源性神经干细胞培养在24孔板中,分成3组,每组8孔,于无血清条件下,切割组加切割侧海马提取液;正常组加正常侧海马提取液;对照组不加上述海马提取液。培养14d后进行微管相关蛋白2(MAP-2)与p-ERK的免疫荧光双标检测。结果MAP-2阳性神经元数量、胞体面积和细胞周长在切割组、正常组和对照组中依次减少,3组之间均有显著性差异。MAP-2、p-ERK免疫荧光双标细胞数量在切割组、正常组、对照组中也依次下降,但双标记细胞数占MAP-2阳性神经元数的百分比却反而依次增加,两者3组之间均有显著性差异,双标细胞大多为欠成熟细胞。结论切割穹隆海马伞侧海马提取液较正常海马提取液有明显促使神经干细胞向成熟神经元分化的作用;形态学初步证实ERK信号转导通路可能与神经干细胞向神经元分化有关。