灰绿藜RNA提取方法及在cDNA文库构建中的应用

目的:为分离灰绿藜耐盐相关新基因,构建叶片cDNA文库,探索从盐生植物中提取高质量RNA的方法。方法:以灰绿藜叶片为材料,应用RNAPlant Reagent法(Tiangen)、Plant RNA purification Reagent法(Invitrogen)、UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法(Sangon)、SDS-LiCl法、TRIZOL试剂法(Invitrogen)等进行总RNA的提取,并构建其全长cDNA文库和抑制消减文库。结果:RNA Plant Reagent法、Plant RNA purification Reagent法和UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法获得的RNA完整性均不好;SDS-LiCl法提取的RNA完整性好(28S条带亮度是18S的2倍、条带锐利清晰)、纯度高(A280/A260为1.89±0.03,A260/A230为2.23±0.02),适合用于直接反转录及构建全长cDNA文库,并获得成功;TRIZOL试剂法简单快捷,产率高(2724±82μg/g),完整性较好,可经mRNA纯化后用于抑制消减文库的构建并获得成功。结论:建立了用于构建高质量cDNA文库的灰绿藜RNA的制备方法。

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106pfu.mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签(EST),序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。

全长cDNA文库构建方法及应用研究

构建全长cDNA文库是获得大量基因全序列信息的有效途径,也是进行功能基因组研究的一条经济、快速的途径,它克服了常规cDNA文库的缺点,极大地推进了功能基因组的研究,尤其是对于那些因基因组庞大而未能进行全基因组序列测定的生物来说更为重要.全长cDNA文库的研究在不断发展,几种文库构建方法已经建立,并得到了较为广泛的应用.本文重点阐述了全长cDNA文库的构建方法,对各种方法进行了分析和比较;同时对全长cDNA文库的应用也作了介绍.

绵毛优若藜冷胁迫均一化全长cDNA文库的构建

以绵毛优若藜叶片和嫩茎为材料，对盆栽的绵毛优若藜小苗进行梯度低温胁迫处理后，采用SMART（switching mechanism at 5’end of RNA transcript）与DSN（duplex-specific nuclease）均一化相结合技术构建绵毛优若藜冷胁迫均一化全长cDNA文库。经测定，原始文库的库容量为1．4×10^6pfu。PCR检测结果显示：插入片段的长度在0．5～3kb之间，平均大于1kb，表明文库构建效果较好。该文库包含有大量的未知基因，有待进一步的发掘和研究。

利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库

Oligo-Capping法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一。笔者在引进、消化和吸收的基础上,通过对特异引物和接头序列的设计,及cDNA扩增反应条件的优化,对该方法进行了一些切实可行的改进,形成了一套简便易行的技术体系。利用本研究中改进的Oligo-Capping法,成功地构建了甘蔗茎全长cDNA文库。综合评价结果表明,本研究中所构建的甘蔗茎全长cDNA文库的库容大于2.5×106cfu,重组率为91%,全长率高达88.9%。本文库的构建为进一步甘蔗茎中全长基因的克隆和功能基因的表达分析奠定了基础。

大豆幼荚全长cDNA文库的构建及鉴定分析

构建大豆幼荚全长cDNA文库,可为克隆与大豆产量相关基因,培育高产大豆新品种奠定基础。以吉农18大豆幼荚突变体为材料,提取大豆幼荚总RNA,反转录成单链cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K消化、Sfil酶切后,采用CHROM SPIN-400柱分级分离,回收500 bp以上的cDNA组分。以λTriplE×2载体连接并进行体外包装,构建吉农18大豆幼荚全长cDNA文库。经检测研究构建的大豆幼荚cDNA原始文库滴度达到1.5×106pfu.mL-1,重组率达92%。扩增的文库滴定达到2.6×108pfu.mL-1,重组cDNA片段长度在500 bp以上。结果显示构建的大豆幼荚全长cDNA文库符合高质量文库的标准,可用于进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究。

甘蔗茎全长cDNA文库构建及EST序列分析

在利用改进的Oligo-capping法构建1个高质量的甘蔗茎全长cDNA文库基础上,对该文库进行大规模测序,获得了283条5′端有效EST序列,平均长度为459 bp,经聚类和拼接获得204个假定独立转录本(TUTs),冗余序列所占比例27.9%。NCBI同源比对分析结果表明,其中132条EST拼接的103个TUTs与已知功能基因具有较高的同源性,结合拟南芥功能基因分类标准对这些TUTs进行分类,可分为12类,以参与蛋白质合成的基因最多,其次为细胞结构、蛋白质降解和贮藏、转录等类型的基因。

干旱胁迫下耐旱稻中旱3号全长cDNA文库的构建

干旱胁迫导致很多基因的表达发生变化。以干旱胁迫下的耐旱稻品种中旱3号为材料,我们用SMART技术（RNA转录5′末端模板转换技术）成功构建一个高质量的干旱胁迫诱导的节水抗旱稻中旱3号全长cDNA文库。体外包装后感染大肠杆菌XL1-Blue宿主菌,未扩展文库的滴度为1.94×10^6pfu/mL,重组率为85.15%。扩展后文库的滴度为1.45×10^11pfu/mL。将λ噬菌体臂转入pTriplEx2质粒,从中随机挑选100个克隆,PCR扩增检测插入片段长度,结果显示文库插入片段在500～2000bp之间。

苦瓜果实商品成熟期均一化全长cDNA文库的构建及分析

为构建苦瓜果实商品成熟期的cDNA文库,并对相关EST进行序列分析,笔者以多肽二号苦瓜亲本‘189-4’商品成熟期果实为材料,利用SMART技术构建其果实的cDNA文库。经检验该文库库容量为2.08×10~6,重组率为96.29%,平均插入片段750~2000 bp,插入片段平均大小约1000 bp。随机挑取400个单克隆进行测序,共获得370条EST,序列分析结果表明350条有同源性,全长率为70%;19条序列无匹配,单一序列为320条,其中,片段重叠群10个,单基因260个,可能与营养品质相关的基因有48个。本研究为苦瓜果实功能基因的筛选、克隆奠定了基础。