Purification and Crystallization of Flammulin,a Basic Protein with Anti-tumor Activities from Flammulina Velutipes

Flammulin, an anti-tumor protein, was purified from the aqueous extract of basidiomes of Flammulina Velutipes to electrophoretic homogeneity and crystallized by microdialysis against a polyethylene glycol- sodium phosphate buffer. The purified product was found to have marked anti-tumor effects and be able to affect the tumor cells directly.

火菇素的圆二色性与溶液二级结构

为了弄清火菇素蛋白的结构与功能的关系并揭示抗癌机理,使其更好地发挥临床作用,测定了火菇素的圆二色性,井用蛋白质二级结构解析程序分析了火菇素的溶液二级结构.火菇素远紫外圆二色性的研究表明,其水溶液在208nm处表现为宽大负峰,最大平均残基摩尔椭圆度[0]_(208)=-6574deg·cm^2·dmol^(-1),在223nm处为肩,经二级结构解析程序计算分析,火菇素的二级结构和二硫键和芳香氨基酸对火菇素圆二色性的贡献分别为77.4％和22.6％,二级结构的组成为:α-螺旋19.7％,β-折叠和β-转角50.1％,无规卷曲和γ-转角30.2％.火菇素二级结构对pH,SDS和乙醇有一定的稳定性,在pH46～9.4范围内,火菇素的结构几乎不发生变化,但在碱性太强的环境中火菇素发生不可逆变性,火菇素对热变性很敏感.

金针菇中具抑瘤活性的碱性蛋白火菇素的分离纯化和性质研究(英文)

目的 对一种具有抑瘤活性的碱性蛋白火菇素进行分离纯化和性质研究。方法 应用硫酸铵、乙醇分级沉淀 ,柱色谱等方法进行分离纯化。电泳分析、氨基酸组成分析、质谱分析等方法被用于火菇素的理化性质研究。结果 火菇素被提纯至电泳纯并结晶。经性质研究确定火菇素的分子量为 19891.13Da ,pI=8.9,λmax=2 76～ 2 78nm ,λmin=2 5 0nm ,并缺少甲硫氨酸。通过基质辅助激光解吸离子化质谱 (MALDI—MS)分析 ,测得了火菇素的指纹图谱 ,表明它为一种新蛋白。结论 火菇素被首次提纯至电泳纯 。

火菇素酪氨酸微区的研究

用紫外差光谱和荧光光谱技术对火菇素的酪氨酸微区进行了研究,结果表明火菇素表现典型的酪氨酸残基紫外275nm吸收峰,ε_(max)=20322L·mol^(-1)·cm^(-1),紫外差光谱滴定发现,当10.1<pH<12.5时,差光谱吸收△A_(294.4nm)与pH变化相关性明显,其酪氨酸表观离解常数pK_a＇=11.4.荧光研究表明,火菇素不含色氨酸而只表现出酪氨酸荧光,在激发波长为280nm时最大发射波长为305nm,pH和SDS对其荧光性质有较大的影响;KI几乎不能猝灭火菇素的荧光,丙烯酰胺是其强猝灭剂.研究表明,酪氨酸残基位于火菇素的疏水内核,在火菇素分子中酪氨酸残基和其它疏水氨基酸残基形成疏水微区,疏水微区结构比较稳定.

金针菇的原生质体单核化

采用显微镜单孢分离技术从金针菇菌株 FL19(黄色品种 )和 880 1(白色品种 )分离刚萌发的原生质体再生菌株 ,分别获得 89和 83株单个原生质体再生菌株 ,并对它们的不亲和性因子基因型进行测定 .结果表明 ,两个亲本的不亲和性因子 A和 B都存在 3个复等位基因 .

火菇素蛋白的免疫印迹检测

从金针菇子实体浸提液中提取了抗癌活性物质火菇素 ,将纯化的火菇素用Freund佐剂乳化后注射到新西兰白兔体内 ,经数次加强免疫后采血并分离了抗血清 ,并以抗血清为探针建立了火菇素蛋白的免疫印迹法定性检测方法。应用免疫学方法检测金针菇菌丝体和子实体 ,结果显示 ,只在金针菇子实体中发现与火菇素抗体相结合的抗原信号。

火菇素提取新工艺及其生物活性测定

火菇素是一种具有抗癌活性的简单蛋白 ,从金针菇中分离纯化火菇素的改进工艺为 :金针菇子实体经乙酸液浸提、硫酸铵和乙醇分级沉淀后 ,通过DEAE SephadexA 5 0除去色素和部分杂蛋白 ,最后经CM SephadexC 5 0离子交换柱层析处理 ,得到了电泳均一的纯化蛋白 ,用微量透析法得到结晶 .理化性质研究结果表明火菇素为分子量 2 370 0 ,等电点pI 8 9,不含糖的简单蛋白 ,最大吸收波长λmax在 2 76～ 2 78nm ,最小吸收波长λmin在 2 5 0nm ,氨基酸组成不含蛋氨酸 .纯化产物对实验动物移植肿瘤的抑瘤作用实验的研究指出 ,火菇素对小鼠肉瘤S180 和艾氏腹水瘤有明显的抑制作用 ,且能延长小鼠的生存期 .毒性实验研究表明 。

金针菇生物活性物质结构与功能的研究进展

金针菇Flammulina velutipes含有多种生物活性物质,具有很高的药用价值。总结了近年来金针菇中火菇素(flammulin)、溶细胞素(flammutoxin)、免疫调节蛋白(Fip-fve)、抗病毒蛋白、跨上皮电抗性蛋白(TEER-TDP)和金针菇多糖(FVP)的研究进展。

火菇素蛋白的红外和拉曼光谱研究

目的 研究抗癌活性蛋白火菇素的二级结构。方法 Fourier变换红外光谱和显微共焦拉曼光谱法。结果火菇素蛋白的二级结构中含有较多的β折叠和α螺旋而无规则卷曲含量较少 ,“埋藏”和“暴露”的酪氨酸残基为34%和 6 6 % ,C- C- S- S- C- C-侧链为反式 -扭曲 -反式构型。

火菇素cDNA的初步免疫学筛选

火菇素是一种具有抗癌活性的简单蛋白 ,从金针菇中分离纯化火菇素的方法如下 :金针菇子实体经乙酸液浸提、硫酸铵和乙醇分级沉淀后 ,通过DEAE SephadexA 5 0除去色素和部分杂蛋白 ,最后经CM SephadexC 5 0离子交换柱层析分离 ,得到了电泳均一的纯化蛋白 .以火菇素为抗原制备的抗血清为探针对构建的金针菇cDNA表达文库进行免疫印记筛选 ,对获得的阳性克隆进行PCR、酶切以及在大肠杆菌中诱导表达等初步鉴定 ,为进一步确证、克隆火菇素基因打下了基础 .

金针菇菌丝体的深层培养及多糖制取

从２０株金针菇菌株中筛选出适于液体发酵的９４Ｂ２株。该菌种适宜的摇瓶培养条件：培养温度２３～２４℃，ｐＨ６．５，接液体种量１０％，装液量≤５０ｍｌ／５００ｍｌ瓶；不同的间歇振荡形式对菌丝球产量和形态有显著影响。深层发酵工艺相似于抗生素发酵。发酵期间发酵液ｐＨ变化幅度很小，总糖、还原糖、氨基氮与菌丝生长量有一定的相关性。发酵酵的菌丝产量可达４７．５ｇ（湿重）／１００ｍｌ、胞外多糖达１７４．７ｋｇ／１００ｍｌ发酵液上清、胞内多糖达３３８．１ｍｇ／１００ｇ湿菌丝体。

火菇素的溶液二级结构与变性动力学

为了弄清抗肿瘤活性物质火菇素蛋白的二级结构及其活性在保存时自然衰减的规律 ,为临床应用提供依据 ,测定了火菇素的圆二色性并用蛋白质二级结构解析程序分析了火菇素的溶液二级结构 ,研究了火菇素的变性动力学 .火菇素的远紫外圆二色性的研究表明 ,其水溶液在 2 0 8nm处表现为大负峰 ,最大平均残基摩尔椭圆度 [θ]2 0 8=- 6574deg·cm2·dmol-1,在 2 2 3nm处为肩 .经二级结构解析程序计算分析 ,火菇素的二级结构组成为 :α螺旋 1 5.2 % ,平行 β折叠片和 β转角6.1 % ,反平行 β折叠片 32 .7% ,无规卷曲和 γ转角 2 3.4% ,其中二硫键和芳香氨基酸对火菇素圆二色性的贡献占 2 2 .6% .热变性几乎使所有的二级结构都遭到破坏 ,转化为无规卷曲 .利用已建立的火菇素免疫单向琼脂扩散定量检测技术 ,对在 4℃下保存的火菇素进行了长期跟踪检测 ,结果表明 ,在保存过程中火菇素的活性逐步降低 ,同时其二级结构也被破坏 .根据实验结果 ,建立了火菇素变性的一级动力学方程模型 :ct=coe-t/τ,该模型方程能很好地拟合实验结果 .根据模型方程计算的火菇素的寿命为 370 d,半衰期为 2 56d.说明火菇素这种很有应用前景的抗肿瘤药物比较容易长期保存 .

抗癌活性物质火菇素的定量技术

从金针菇子实体浸体液中提取了火菇素，用微量透析法得到火菇素结晶。结晶火菇素用Freund完全佐剂乳化后注射到新西兰白兔体内，经数次加强免疫后采血并分离了抗血清，免疫双扩散显示它能与火菇素形成免疫沉淀线，效价为1：4。根据火菇素在血清平板上免疫单向琼脂扩散的结果，建立了不同浓度火菇素免疫反应的标准曲线，可用于火菇素的定量检测。

火菇素抗体探针的制备与高灵敏度的火菇素定性技术的建立

从金针菇子实体浸提液中提取了抗癌活性物质火菇素 ,将纯化的火菇素用Freund佐剂乳化后注射到新西兰白兔体内 ,经数次加强免疫后采血并分离了抗血清 ,应用免疫学方法检测与硝酸纤维素滤膜上抗原蛋白相结合的抗体探针 ,检测极限可达 2 0 - 4

火菇素的分离纯化及其分子量的测定

火菇素是一种从金针菇FlammulinaVelutipes中分离纯化出来的具有抗癌活性的简单蛋白。用SDS-PAGE系统,通过与已知分子量的标准参照蛋白比较,确定火菇素的分子量为24kDa,这一结果与其氨基酸组成分析相比偏大,进一步通过电喷雾离子化质谱法(ESIMS)分析,精确测定火菇素的分子量为19891.13Da。推测由于火菇素蛋白与SDS的非正常结合是造成蛋白质在SDS-PAGE中迁移变慢导致偏差的原因。

火菇素纯化流程的改进

利用前文建立的火菇素免疫单向琼脂扩散定量检测技术 ,对火菇素纯化流程作了定量监测 ,针对一、二、三等金针菇原料的不同特点 ,对纯化技术作了相应改进 ,可分别使火菇素的提取率提高 71 .3% ,1 87.6%和 2 1 7.9% ,1Kg风干子实体的火菇素产量达到 1 0 9.1mg ,52 .3mg和 2 7 0mg .