运用融合PCR技术敲除光滑念珠菌FLO8基因以及其对EPA黏附素家族表达的影响

目的:构建光滑念珠菌FLO8基因敲除株,并分析FLO8敲除对光滑念珠菌上皮黏附素(epithelial adhe-sin,EPA)家族表达的影响。方法:使用融合PCR技术,以光滑念珠菌ATCC2001菌株基因组DNA、带有筛选标记诺尔斯菌素抗性基因(NAT)的质粒DNA为模板,构建敲除组件。采用醋酸锂转染法将敲除组件转染入ATCC2001中,从而获得flo8△菌株。使用实时荧光定量PCR检测菌株中EPA1、EPA6和EPA7基因的表达。结果:获得光滑念珠菌FLO8基因敲除株flo8△,该菌株的EPA1、EPA6和EPA7基因表达水平对明显低于ATCC2001株(P均<0.001)。结论:此法可便捷、有效地构建光滑念珠菌基因敲除菌株。敲除FLO8基因后,光滑念珠菌的EPA家族表达降低,为进一步研究光滑念珠菌毒力机制奠定基础。

融合PCR结合同源重组技术敲除白色假丝酵母菌FLO8基因

目的运用融合PCR和同源重组技术敲除白色假丝酵母菌FLO8基因,并初步分析敲除菌株药物敏感性(药敏)情况。方法运用融合PCR将FLO8基因的上下游片段与筛选标记融合在一起构成同源敲除组件,再用高效醋酸锂转染法将敲除组件转染入白色假丝酵母菌SN152,在营养缺陷板上进行筛选,通过2次同源重组敲除FLO8的2条等位基因。采用点板法比较FLO8未敲除株与敲除株药敏情况。结果成功构建白色假丝酵母菌SN152 FLO8双等位基因缺失株,且耐药性FLO8^(-/-)>FLO8^(+/-)>SN152。结论融合PCR结合同源重组技术能高效、快速构建白色假丝酵母菌FLO8基因缺失株,白色假丝酵母菌FLO8基因与药敏相关,且FLO8拷贝数越少耐药性越强。

白念珠菌FLO8基因突变株构建及鉴定

目的构建白念珠菌FLO8基因突变株。方法将白念珠菌FLO8基因插入pCP20质粒载体ADH1启动子之后,通过定向诱变获得FLO8基因R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变质粒载体,再通过同源重组技术将带有FLO8突变的基因片段整合至SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结果通过测序鉴定FLO8基因突变质粒载体构建成功;通过PCR验证表明突变FLO8基因整合到SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结论以pCP20质粒为载体,通过定向诱变、同源重组等技术,可以高效构建白念珠菌FLO8基因突变株。

转录因子Flo8 G723R、T751D突变增强白念珠菌毒力

目的研究白念珠菌转录因子Flo8 G723R和T751D突变与毒力的关系。方法比较白念珠菌Flo8野生株SN152、Flo8回复株Flo8SN152、Flo8突变株Flo8^(G723R)和Flo8T751D感染小鼠的致死率和肾脏菌量负担,同时检测各菌株毒力因子的基因表达情况,分析Flo8突变与白念珠菌毒力的关系。结果与SN152和Flo8SN152相比,转录因子Flo8突变株Flo8G723R和Flo8T751D感染小鼠的致死率更高、肾脏菌量负担更高,毒力因子的基因表达也有不同程度的增强。结论转录因子Flo8 G723R和T751D突变使白念珠菌毒力增加,部分毒力因子的基因表达增强。

啤酒酵母FLO8基因敲除对酵母发酵性能的改良

利用PCR介导基因中断技术,以pUG6为模板,设计含有与flo8基因两侧序列同源的长引物,构建带有卡那抗性基因(KanMX)中断盒,转化啤酒酵母G-03,获得一株转化菌G-03/f8。对转化菌G-03/f8和原菌G-03进行生理生化性能和摇瓶发酵性能比较。该菌株在实验室常规发酵中,生理性能、发酵性能基本上与出发菌株保持一致。当用酵母提前絮凝(PYF,premature yeast flocculation)值高的麦芽糖化后的麦汁接种发酵时,G-03/f8的絮凝性能与常规发酵下的絮凝性能基本一致,此时明显优于出发菌株G-03。G-03/f8的酒精度、发酵度等低温发酵指标与常规发酵相比有小幅度的下降,但明显高于此时G-03的各项发酵指标。相对于出发菌而言,G-03/f8对高PYF值的麦汁不敏感,能够保持较好的发酵性能,因此在高PYF值麦芽的利用上有良好的应用前景。

白念珠菌FLO8基因高表达菌株构建及鉴定

目的 :构建白念珠菌FLO8基因高表达菌株。方法 :将白念珠菌FLO8基因插入p CP20质粒载体ADH1启动子后,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)将ADH1-FLO8-Lox P-ARG4-Lox P-ADE2片段扩增,并通过同源重组技术将该片段整合至SN152的ADE2位点。结果:通过测序鉴定FLO8基因高表达质粒载体构建成功;通过同源重组及实时反转录PCR验证表明FLO8基因整合到SN152菌株的ADE2位点并且表达量增高。结论:以p CP20质粒为载体,通过同源重组等技术,可高效构建白念珠菌FLO8基因高表达菌株。