应用Ca^(2+)荧光探针fluo-3和fluo-4测定H_2O_2诱导的A549细胞凋亡过程中的[Ca^(2+)]_i变化

背景与目的肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤,Ca2+对于肿瘤细胞凋亡有重要的调控作用。实时监测肺癌细胞内Ca2+水平,有助于深入研究Ca2+介导肺癌细胞凋亡的分子机制。本研究旨在观察Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4在H2O2诱导的A549细胞凋亡过程中的应用,实时测定胞浆Ca2+浓度([Ca2+]i),探讨[Ca2+]i与细胞凋亡的关系,并比较两种Ca2+探针在荧光强度及[Ca2+]i测定值方面的差异。方法采用Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4负载细胞,1 h后用不同浓度的H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况。结果在相同的探针浓度、负载时间和相同的图像采集参数的条件下,选定细胞内fluo-4平均荧光强度高于fluo-3。50 mM H2O2刺激后,A549细胞胞浆内[Ca2+]i迅速升高,通过公式计算发现采用fluo-3探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是112.2 nM-1,069.6 nM,采用fluo-4探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是7.6nM-505.4 nM。同时发现经H2O2刺激后,凋亡细胞百分比明显增加(P<0.01)。结论 H2O2促进A549细胞内Ca2+释放,诱导细胞凋亡。Ca2+探针fluo-4可能更适合于监测含量较低的细胞中[Ca2+]i变化。

荧光探针Fluo-3/AM和FuraRed测量单细胞中比率钙

应用ACAS570激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM简称共焦显微镜）和钙离子指示剂Fluo－3／AM、FuraRed荧光探剂双标记技术，测定了单个活细胞内比率钙的动态变化。结果显示37℃，Fluo－3／AM浓度10μmol／L，FuraRed浓度10μmol／L的条件下，昆明小鼠巨噬细胞负载1h左右即可获良好的标记效果。用比率探针测量细胞内Ca^2＋的动态变化，使Ca^2＋的定性定量测定不受染料浓度、细胞大小、照射光强度以及一定程度的光漂白和染料泄漏等因素的影响，提供了一种准确定性定量细胞内Ca^2＋的实时、动态、原位变化的新方法。

采用Fluo-3 AM-ester探针研究桃不同组织的Ca^2＋信号分布

钙作为植物最重要的矿质元素之一,在植物生理和生化活动中起重要作用。采用激光扫描共聚焦显微镜,以Fluo-3 AM-ester为荧光探针研究了桃果肉和叶柄组织中Ca2+的分布,结果表明Fluo-3 AM-ester可作为荧光探针对桃不同组织中游离的Ca2+信号强度和分布特征进行分析。不同的物镜观察(10×和20×)下,Ca2+荧光信号相对强度差异不大;在叶柄中Ca2+荧光信号主要分布于维管束,在果实中多分布于细胞壁;但叶柄中荧光信号分布明显高于果肉组织,这与钙在不同组织中的功能有关。

Ca^(2+)荧光蛋白探针Cameleon和荧光染料探针fluo-3测定H_2O_2刺激的A549细胞中Ca^(2+)浓度变化

目的:本研究旨在观察Ca2+荧光蛋白探针Cameleon和荧光染料探针fluo-3在H2O2刺激的A549细胞中的应用,实时测定细胞质Ca2+浓度([Ca2+]i),并比较两种Ca2+探针在荧光曲线及[Ca2+]i测定值等方面的差异。方法:采用Ca2+荧光蛋白探针Cameleon YC3.6转染A549细胞,24h后用50mmol/L H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用Ca2+荧光染料探针fluo-3负载细胞,1h后用50mmol/L H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况。结果:采用Cameleon探针转染的细胞中,反映[Ca2+]i变化的R值曲线迅速升高后逐渐降至刺激前水平,通过公式计算发现[Ca2+]i变化范围是33.1-596.1 nmol/L。采用fluo-3探针负载的细胞中,反映[Ca2+]i变化的荧光强度F值曲线逐渐升高至稳定,通过公式计算得到[Ca2+]i变化范围是131.8-695.6 nmol/L。同时发现经H2O2刺激后,凋亡细胞百分比显著增加(P<0.01)。结论:Ca2+荧光蛋白探针Cameleon YC3.6和荧光染料探针fluo-3均检测到H2O2诱导的细胞内[Ca2+]i变化,Cameleon YC3.6可能更灵敏地反映快速变化的钙信号。

激光扫描共聚焦显微镜和Fluo-3/AM检测细胞内游离钙

利用细胞培养技术，Ｃａ２＋敏感荧光探针Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ标记细胞，激光扫描共聚焦显微镜检测鸡胚胎巨噬细胞内游离钙浓度（〔Ｃａ２＋〕ｉ）的变化。结果显示细菌脂多糖（ＬＰＳ）可引起培养的鸡胚胎巨噬细胞内〔Ｃａ２＋〕ｉ升高，ＬＰＳ的作用可被维拉帕米部分抑制。本实验表明激光扫描共聚焦显微镜结合Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ能准确迅速地检测单个或多个贴壁粘附细胞胞内〔Ｃａ２＋〕ｉ的动态变化，并同步观察细胞的形态及其荧光分布情况。

激光扫描共聚焦显微镜检测Fluo-3 AM负载大鼠心肌微血管内皮细胞最佳浓度和时间的探讨

为了探讨Ca2+荧光探针Fluo-3 AM对大鼠心肌微血管内皮细胞(Rat Myocardial Microvascular Endothelial Cells RMMECs)最佳装载浓度和时间。将Fluo-3 AM分别稀释成1、2、3、4、5μM/L,每一浓度的探针分别装载细胞5、10、15、20min,应用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内荧光信号的强度、位置、装载探针后细胞的形态来观察装载效果。结果表明:1～3μM/L的Fluo-3 AM负载5～20min均不出现荧光信号;4μM/L的Fluo-3 AM负载5～10min时即出现荧光信号;5μM/L的Fluo-3 AM孵育细胞15min后出现清晰且分布均匀的荧光信号。Fluo-3 AM对贴壁生长的RMMECs负载效果主要受探针浓度和负载时间的影响。

用Fluo3-AM测定2型糖尿病患者淋巴细胞内Ca^(2+)浓度及药物对患者胞内Ca^(2+)浓度的影响

用 Fluo 3- AM为荧光探针 ,测定 2型糖尿病患者淋巴细胞内 Ca2 +浓度 ,观察了肾上腺素、多巴酚丁胺、Bay K 864 4、胰岛素等药物对胞内 Ca2 +的作用机制。实验表明患者胞浆内 Ca2 +浓度与正常人相比显著升高 ;药物对胞内 Ca2 +的刺激表明 ,病人对外界钙激动剂更敏感。胰岛素能刺激胞内 Ca2 +浓度升高 ,其作用机制是激活钙离子通道。肾上腺素不仅能激活钙离子通道 ,也能促使钙从钙池中释放。上述研究也表明 Fluo- 3是有效的研究胞内 Ca2 +变化的荧光探针。 2型糖尿病的发生可能与 Ca2 +浓度升高有关 。

Fluo-3检测细胞内钙离子的条件优化

目的:优化用于检测细胞内钙离子的Fluo-3浓度条件和羧苯磺胺浓度条件,以得到最适的检测用浓度组合。方法:应用析因实验设计方法,选择32种不同的Fluo-3和羧苯磺胺浓度组合孵育CHO-K1细胞,通过FlexStation检测平台检测细胞内的钙离子浓度。结果与结论:检测信号随着Fluo-3浓度的升高而增强,同时随着羧苯磺胺浓度的升高而减弱。4μmol/L的Fluo-3和1mmol/L的羧苯磺胺浓度组合是最适用的检测条件。

2,3,7,8-TCDD对培养乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度影响的研究

目的测定培养SD大鼠乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i,观察2,3,7,8四氯二苯并二噁英(2,3,7,8tetrachlorodibenzopdioxin,以下略为TCDD)对心肌细胞[Ca2+]i的影响。方法将实验动物分为0.05、0.5、5、10μg/kg4个染毒组,采用Fluo3/AM同时加入PluronicF127作为细胞内游离钙离子的荧光探针,负载培养的心肌细胞,应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)技术检测空白组及染毒组乳鼠心肌细胞[Ca2+]i。结果静息时,心肌细胞[Ca2+]i为(77.68±12.00)nmol/L。染毒组心肌细胞的[Ca2+]i显示不同程度的升高,且呈剂量依赖性。结论应用Fluo3/AM和PluronicF127结合CLSM技术可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度,TCDD可能通过某种机制增加心肌细胞[Ca2+]i,从而对乳鼠心脏功能产生一定损伤。

人α1,3-岩藻糖基转移酶IV荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-N1-FUT4真核表达载体.方法:采用RT-PCR方法获得α1,3-岩藻糖基转移酶IV(FUT4)全长基因,克隆至pEGFP-N1-FUT4表达载体并进行鉴定.通过脂质体转染到人表皮癌细胞系A431中,荧光显微镜下观察并经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测FUT4的表达.结果:测序及酶切鉴定证明获得人全长FUT4基因,FUT4基因正确插入pEGFP-N1中,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在A431细胞中的表达,RT-PCR和Western blot检测结果显示FUT4的表达明显增加.结论:成功构建绿色荧光蛋白为报告基因的FUT4真核表达载体,并检测到在A431细胞中的表达.

2,3-二羟喹喔啉的合成及其在微量铅分析中的应用

合成了新荧光试剂2.3-二羟喹喔啉(DHQX),并研究了Pb(Ⅱ)对它的荧光熄灭作用,建立了荧光熄灭法测定食醋中的微量Pb(Ⅱ),检出线性范围为0～75pg/25mL,结果满意。

5-羟色胺对培养胃底平滑肌细胞内游离钙动员的影响

目的 研究 5 - HT诱导胃底平滑肌细胞内钙动员的机制 .方法 采用 Ca2 +指示剂 Fluo- 3/ AM作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的胃底平滑肌细胞 ,共聚焦技术检测细胞内钙荧光强度的变化 .结果 基础状态下 SFSMC[Ca2 + ]i 荧光强度 (FI)为 2 6 4± 15 ,5 - HT 10μmol· L- 1 使荧光强度的变化 ΔFI为 16 .5± 2 .6 ;细胞外无钙时 ,5 - HT升高[Ca2 + ]作用被减弱 ,但除去细胞外钙 ,并使用内罗啶 (ryan-odine)孵育后 ,5 - HT 不再引起荧光强度的变化 ;10μmol· L- 1 米安舍林 (mianserin)可部分拮抗 5 - HT升高[Ca2 + ]i 的作用 ,赛更定 (cyprohetadine)不能抑制 5 - HT升高的胞内钙 ;Mn92 0 2和拉西地平 (lacidipine)均能完全抑制 5 -HT升高 [Ca2 + ]i 的作用 .结论 5 - HT可通过促进外钙内流及钙池 (SR)释放使 [Ca2 + ]i 升高 ;在胃底平滑肌 5 - HT升高胞内钙部分通过 5 - HT2 受体 ,而不是通过 5 - HT1 C受体 ;5 -羟色胺通过 L型钙通道促外钙内流 ;二氢吡啶类钙拮抗剂能通过阻滞 L 型钙通道 ,而完全抑制 5 -

大鼠胃底平滑肌细胞5-HT受体的信号转导通路的研究

目的 以 5 HT引起胞内Ca2 + 变化为指标 ,研究大鼠胃底平滑肌细胞 5 HT受体的信号转导机制。方法 采用Ca2 + 指示剂Fluo - 3/AM负载培养的胃底平滑肌细胞 (SF SMC) ,共聚焦显微术检测细胞内钙荧光强度的变化。结果 基础状态下SFSMC[Ca2 + ]i 荧光强度 (fluorescenceintensi ty ,FI)为 2 6 4± 1 5 ,5 HT 10 μmol·L-1使荧光强度缓慢升高 ;这一作用与细胞外钙内流和内钙释放有关 ;10 μmol·L-1米安舍林 (mianserin)可部分拮抗 5 HT升高 [Ca2 + ]i 的作用 ,钙拮抗剂拉西地平 (lacidipine)、G蛋白拮抗剂NEM均能完全抑制 5 HT升高 [Ca2 + ]i 的作用 ;5 HT引起 [Ca2 + ]i的升高被PLC抑制剂部分地取消 ;PKC激动剂拮抗了 5 HT引起的钙动员 ,而PKC特异性抑制剂D 鞘氨醇取消了这一抑制作用。结论 5 HT部分通过激动了胃底平滑肌细胞的G 蛋白偶联的 5 HT2B受体引起细胞去极化 ,从而激发L型钙通道使外Ca2 + 内流 ,并促进SR上的ryanodine受体的开放 ,引起 [Ca2 + ]i 升高。而这一升高 [Ca2 + ]i

低强度He-Ne激光照射对离体小鼠巨噬细胞Ca^(2+)浓度的影响

为研究低强度Ｈｅ－Ｎｅ激光照射对离体小鼠巨噬细胞内Ｃａ２＋浓度的影响以及其与能量密度（剂量）的关系，用Ｆｌｕｏ－３乙酰甲脂对巨噬细胞Ｃａ２＋作荧光标记，应用图象分析系统检测激光照射后细胞内Ｃａ２＋的荧光强度变化。结果：Ｈｅ－Ｎｅ激光照射引起细胞内Ｃａ２＋浓度改变。照射５ｍｉｎ，激光剂量为０．６７９Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度出现非常明显的增强；照射１０ｍｉｎ，剂量为１．３５８Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度增强达到最大值；照射１５ｍｉｎ，剂量为２．０３７Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度减弱；照射２０ｍｉｎ，剂量为２．７１６Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度降低至对照组之下。低强度Ｈｅ－Ｎｅ激光照射巨噬细胞可引起细胞内Ｃａ２＋浓度上升，产生细胞内信号传递，进而控制细胞功能。

多非替利衍生物CPU228(V03)对大鼠心室肌细胞钙瞬变的调节

目的 :在β 受体激动情况下 ,研究多非替利衍生物CPU 2 2 8对电刺激触发心肌细胞的胞浆Ca2 + 浓度([Ca2 + ]i)变化及钙瞬变动力学参数的影响。方法 :游离单个大鼠心室肌细胞 ,Fluo 3 AM负载 ,电刺激诱发心室肌细胞钙瞬变 ,定量测定心室肌细胞内Ca2 +浓度变化 ,异丙肾上腺素 (isoproterenol,ISO) 10 0nmol·L-1激动β 受体 ,观察CPU 2 2 81μmol·L-1对钙瞬变动力学参数、[Ca2 + ]i 及钙负荷水平的影响。结果 :CPU2 2 81μmol·L-1对大鼠心室肌细胞 [Ca2 + ]i 的影响不明显 (P >0 .0 5 ) ;ISO 10 0nmol·L-1显著升高大鼠心室肌细胞 [Ca2 + ]i 和细胞内钙负荷水平 ,缩短钙瞬变时程 ,并且增加钙瞬变的消除速率。CPU 2 2 81μmol·L-1显著抑制ISO的上述作用。结论 :在β 受体激动情况下 ,CPU 2 2 8可以降低心肌细胞 [Ca2 + ]i,使ISO改变的钙瞬变动力学参数恢复到正常水平。

增强UV-B辐射对小麦根尖细胞游离钙离子分布的影响

以小麦根尖为材料,利用低温装载法在根尖细胞中成功地装载了酯化形式的钙离子荧光指示剂fluo-3/AM,利用激光共聚焦显微技术检测了增强UV-B辐射后小麦根尖细胞内游离钙离子荧光强度的分布,并对胞质内游离钙离子浓度进行了测定.结果表明：（1）对照组小麦根尖细胞内钙离子荧光主要分布于细胞胞质周缘;而经UV-B辐射处理后,细胞内钙离子荧光不仅分布在胞质周缘,且在细胞壁与胞间隙可观察到大量钙离子荧光.（2）对单个细胞内钙离子荧光强度进行测定,发现UV-B处理使细胞胞质内游离钙离子浓度明显升高.

增强UV-B辐照对小麦幼苗叶肉细胞内Ca^(2+)水平的研究

以小麦(Triticum aestivum)幼苗叶片为材料,利用提取原生质体方法在小麦幼苗叶肉细胞中成功地装载了钙离子荧光指示剂fluo-3/AM,采用激光共聚焦显微技术检测了增强UV-B辐射后小麦幼苗叶肉细胞内游离钙离子荧光强度的分布,并对[Ca2+]i进行了测定。结果显示,对照组细胞内钙离子荧光分布较均匀,主要分布于紧贴质膜处和核周围,UV-B辐射组钙离子荧光与对照组分布相似,但其原生质体表面不如对照组平滑;同时发现增强UV-B辐射组细胞内钙离子荧光强度值较对照组高,说明增强UV-B辐射组小麦幼苗叶肉细胞维持较高浓度的钙离子水平。这些变化表明Ca2+信号有可能以一定的方式参与了小麦响应UV-B辐射胁迫的过程。

九节龙皂甙对Hela细胞生长的抑制作用

目的 观察九节龙皂甙 (Ardiusilloside)对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用。方法 九节龙皂甙 6 2 5mg·L-1处理Hela细胞 0～ 72h ,在不同时间点采用光镜观察Hela细胞形态 ,以琼脂糖凝胶电泳检测Hela细胞凋亡DNA的梯形带 ;应用特异性Ca2 + 荧光探测剂Fluo 3 /AM在LSCM条件下检测不同时期细胞内Ca2 + 分布情况。结果 光镜下体外培养的Hela细胞在九节龙皂甙作用 2 4h开始出现细胞质皱缩和细胞核凝缩等凋亡的形态学特征。 60、72h均检测出DNA梯形带等凋亡的生物化学特征。诱导Hela细胞48、60、72h内Ca2 + 严重超载且维持在较高浓度水平。结论 九节龙皂甙对体外培养的Hela细胞具有明显的抑制作用且诱导Hela细胞凋亡发生 ;细胞凋亡时细胞内 [Ca2 +

低温处理对冬、春小麦细胞Ca^(2+)时空变化的影响

用Fluo 3/AM染色 ,通过激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)方法 ,对静息态及连续降温条件下不同抗寒性小麦(TriticumaestivumL .)叶肉细胞原生质体 [Ca2 + ]cyt (thefreeCa2 + concentrationinthecytoplasm)的时空变化进行了比较。结果表明 ,静息态下小麦原生质体整体荧光强度基本不变 ,暗示 [Ca2 + ]cyt能维持在一稳定水平 ;同时 ,不同品种小麦间也显示了 [Ca2 + ]cyt水平荧光强度的不同。温度由 15℃连续降至约 2℃时 ,抗寒冬小麦 [Ca2 + ]cyt出现升高后的回复 ,2℃之后逐渐升高 ;冷敏感春小麦则无此回复过程 ,而是一直升高到最大值。推测这一不同的动态变化最终决定了植物在低温下产生冷适应的不同能力。这进一步为“Ca2 + 是低温下生理信号的传导者”

小檗碱对豚鼠心室肌细胞胞浆内游离钙离子浓度的影响

研究小檗碱对豚鼠心肌细胞胞浆 [Ca2 + ]i 的影响 .用酶解法分离单个豚鼠心肌细胞 ,Fluo- 3/AM标记胞浆内游离钙离子 ,激光扫描共聚焦显微镜实时测定胞浆 [Ca2 + ]i变化 .结果 ,小檗碱 1 -1 0 0 μmol· L-1对正常台氏液中静息状态细胞胞浆[Ca2 + ]i 无明显影响 ;小檗碱 1 μmol·L-1对 KCl30mmol·L-1引起的细胞外钙内流有抑制作用 ( P<0 .0 1 ) ,而小檗碱 1 0 0 μmol·L-1对细胞内钙库释放有强烈激动作用 ( P<0 .0 1 ) .结果提示在豚鼠心肌细胞上低浓度小檗碱即能抑制电压依赖性钙通道 ,而高浓度时又能激动细胞内钙库释放 .