基于代谢组学和转录组学挖掘荷叶生物碱合成途径关键基因

为探究荷叶生物碱生物合成的分子机制,对生物碱含量差异显著品种‘太空莲’(高生物碱含量)、‘巨无霸’(中生物碱含量)和‘大足红莲’(低生物碱含量)的成熟荷叶进行代谢组学和转录组学测序分析。代谢组学分析发现,在‘大足红莲’及‘太空莲’(低生物碱含量vs高生物碱含量)、‘大足红莲’及‘巨无霸’(低生物碱含量vs中生物碱含量)、‘太空莲’及‘巨无霸’(高生物碱含量vs中生物碱含量)3组中分别存在30、32、14种差异代谢物。这些差异代谢物主要为3类异喹啉类生物碱——苄基异喹啉类、双苄基异喹啉类、阿朴啡类生物碱,包括山矾碱、3′-葡萄糖基-6,7-二羟基-N-甲基-苄基四氢异喹啉、多巴胺、L-酪胺等。为了挖掘上述异喹啉类生物碱生物合成途径的关键基因,进一步对3个品种进行转录组学测序分析。结果表明,‘大足红莲’及‘太空莲’、‘大足红莲’及‘巨无霸’、‘太空莲’及‘巨无霸’3组中的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)分别为2 866、2 739、3 932个,共有的DEGs有379个,这些共有基因中含有异喹啉类生物碱生物合成途径基因。结合代谢组学分析结果,最终筛选并通过实时荧光定量聚合酶链反应验证得到6个关键DEGs——NnCYP80G、Nn6OMT、NnTYDC、NnNCS、NnRAV和NnERF,它们可用于后续基因功能验证和分子调控网络解析。

玉米自交系干旱应答基因的鉴定(英文)

为开发耐旱分子选择标记提供有用信息,用mRNA差异显示技术分离耐旱玉米自交系‘81565’在干旱胁迫与灌溉对照之间差异表达的基因,发现MD1、MD2和MD3二个在干旱胁迫下差异表达的片段。MD1和MD2为下调表达,MD3为上调表达。序列分析和同源性比对表明,MD1与编码成熟酶的玉米叶绿体基因matK有97%的相似性,MD2与极端耐旱植物Sporobolus stapfianus编码丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的PP2C基因有99%的相似性,MD3与属精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类的水稻metacaspase酶基因有99%的相似性。根据MD2片段序列,结合电子克隆和RT-PCR方法,克隆出一条1731 bp的全长cDNA序列,它编码388个氨基酸。此氨基酸序列包含丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C的催化中心结构域,被认定为玉米PP2C基因族的新成员,命名为ZmPP2Ca。实时荧光定量PCR结果表明,在干旱胁迫下,ZmPP2Ca基因在3个耐旱自交系中呈下调表达,在2个不耐旱自交系中呈上调表达。

大鼠缺血脑中差异表达基因的研究

目的鉴定大鼠脑缺血差异表达基因。方法复制大鼠大脑中动脉栓塞急性脑缺血模型,采用荧光差异显示RT-PCR法结合反Northern杂交快速鉴定差异表达基因。结果发现差异表达的基因9个,其中6个已知的序列和3个未知序列;已知基因中上调的是musmusculusab1-interactor1,homosapiensCGI-99protein,tissueinhibitorofmetalloproteinase3,homosapiensnuclearreceptorco-repressor,下调的是homo-sapiensnuclearmatrixproteinp84和coatomerproteincomplex,subunitgamma2。结论荧光差异显示法结合反Northern杂交是一种有效的快速鉴定差异表达基因的方法;脑缺血时,缺血侧和非缺血侧存在基因的差异表达。

应用FDDRT-PCR技术研究低剂量过氧化氢诱导细胞适应性反应的基因差异表达

目的用荧光差异显示RT-PCR(FDDRT-PCR)技术寻找低剂量的过氧化氢(H2O2)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)适应性反应差异表达的基因,为进一步研究低剂量的环境化学污染物(ECPs)诱导机体的生物学效应及其机制提供科学依据。方法依据H2O2对MRC-5毒性的剂量反应关系,选择低剂量和高剂量,并建立低剂量H2O2诱导MRC-5的适应性反应模型。用乳酸脱氢酶漏出率(LDH%)、Annexin V/PI检测细胞凋亡验证适应性反应模型。然后用FDDRT-PCR寻找不同方式刺激下差异表达的基因,鉴定和验证部分差异表达的基因。结果MTT获得适应性反应的模型,乳酸脱氢酶漏出率和Annexin V/PI检测细胞凋亡的结果都验证了适应性反应的模型。对不同方式处理的细胞RNA进行FDDRT-PCR,找到60个差异条带。对其中的5个差异条带进行鉴定,发现其中4个已知基因(bcl-2、EIF3S5、NDUFS4、RPS10),1个新基因。荧光定量PCR技术证实5个基因在不同处理组中的表达与荧光差异显示PCR图谱上一致。结论低剂量H2O2可以诱导MRC-5的适应性反应过程,其中bcl-2、EIF3S5、NDUFS4、RPS10在该过程中起着一定的作用。

胃癌中高表达ATP/GTP结合蛋白1基因的筛选及验证

目的:探讨胃癌中差异表达的基因在胃癌发生和发展的分子机制中的作用.方法:提取胃癌组织样本的总RNA,通过荧光差异显示技术(DD-PCR)获得胃癌样品中差异的片段,对这些片段进行克隆和测序.通过在GenBank中同源性检索,查找与差异片段相对应的同源基因.利用半定量PCR及定量PCR方法验证该基因表达的差异性.结果:通过DD-PCR得到差异片段中的一个片段对应与人ATP/GTP结合蛋白1基因(A/GTPBP1).半定量PCR及荧光定量PCR技术检测结果表明,A/GTPBP1基因在胃癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织.该基因的读码框长3561bp,编码1186个氨基酸,分子质量为84.4kDa,蛋白质相似性分析表明该蛋白为G蛋白家族成员.结论:A/GTPBP1在胃癌组织中异常高表达,可能在胃癌发生过程中起调节作用。

低剂量的氢醌诱导细胞损伤耐受差异表达基因的研究

目的探讨低剂量氢醌(HQ)诱导人胚肺成纤维细胞(HLF)损伤耐受差异表达的基因。方法参照本实验室用MTT法所得的HQ对HLF毒性的剂量效应关系,选择100pmol/L的HQ为低剂量,100μmol/L的HQ为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒:空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组(先用低剂量预刺激24h,再用高剂量刺激6h,然后用荧光差异显示PCR寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定同源性比较。结果按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR,找到33个差异条带。对其中的8个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中1个已知基因,7个未知基因。结论用荧光差异显示PCR方法寻找HQ诱导HLF损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究低剂量HQ诱导HLF损伤耐受的机制提供科学依据。

rRT-PCR法在脊髓灰质炎病毒型内鉴定中的应用

目的应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)对脊髓灰质炎病毒(PV)进行型内鉴定,并对该方法进行评估。方法采用世界卫生组织(WHO)推荐的脊髓灰质炎ITD和VDPV rRT-PCR方法对江西省既往分离的14株脊髓灰质炎毒株和2013年分离的15株脊髓灰质炎毒株进行ITD和VDPVs筛选,并将检测结果与毒株的VP1编码区核苷酸序列测定结果进行比较分析。结果 ITD rRT-PCR的实验结果除1株毒株漏检外,其余与毒株的VP1编码区序列测定结果完全相符,VDPV rRT-PCR的结果与VP1编码区序列测定结果不完全相符,共有14株Ⅱ型脊髓灰质炎病毒疫苗类似株被错判为VDPV株,11株Ⅲ型VDPV株错判为疫苗类似株。结论对脊髓灰质炎型内进行rRTPCR鉴定的方法可以替代中和试验的常规检测方法,但不能完全取代测序技术用于脊髓灰质炎VDPV的鉴定。