樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。

一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。

实时荧光定量RT-PCR分析非小细胞肺癌SATB1的表达和临床病理意义

目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织及正常肺组织中SATB1 mRNA的表达,分析SATB1基因表达与临床病理参数的相关性。结果癌组织中SATB1 mRNA表达量为正常组织13倍,两者差异显著(P<0.001),其中有、无转移组分别为正常组织23.63倍和5.57倍。结论SATB1 mRNA的表达水平可能与非小细胞肺癌发生发展及淋巴转移有关,有望成为判断非小细胞肺癌预后的一个指标。

RT-PCR检测病媒生物SARS冠状病毒结果初报

目的 调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主 ,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据。方法 巢式RT -PCR技术、荧光定量RT -PCR技术。结果 利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山、江门及恩平等地的 160份鼠肺样品及 15份蜚蠊的体表擦拭子检测结果表明 ,荧光定量RT -PCR未检测到阳性 ,巢式RT -PCR显示来自广州市的 1份蜚蠊体表擦拭子呈可疑阳性。结论 巢式RT -PCR、荧光定量RT -PCR都适合于病媒生物SARS冠状病毒的初步筛选 ,目前未有明显证据显示鼠类及蜚蠊携带和传播SARS冠状病毒 ,仍需作进一步研究。

‘琯溪蜜柚’荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚’的管家基因,并筛选合适的管家基因作为内参,【方法】以‘琯溪蜜柚’盛花期后5个不同时期的果实汁胞,以及根﹑茎﹑叶为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α和Ubiquitin 5个管家基因在不同材料中的表达情况,并结合geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT和BestKeeper 4种评估方法进行稳定性分析。【结果】结果表明,actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚’果实发育进程中较为稳定的内参基因,而EF1-α和β-tubulin则是研究不同组织特定靶基因表达中稳定的内参基因。【结论】筛选出了‘琯溪蜜柚’最佳的内参基因β-tubulin,为今后目的基因的表达分析奠定了基础。

实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物.

应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。

荧光定量PCR技术检测疟原虫方法初探

目的探索荧光定量PCR技术在献血者疟原虫检测中的应用。方法参照文献设计针对疟原虫18S小亚基核糖体RNA (18S rRNA)基因序列的通用引物和探针并构建标准质粒;将标准质粒和4种疟原虫阳性标本进行梯度倍比稀释后进行荧光定量PCR检测,建立符合本实验室条件的实验体系,与巢式PCR方法进行灵敏度比较,并对47例献血者进行疟原虫筛查。结果应用荧光定量PCR技术检测标准质粒的检测下限是10-1copy/μL,用于恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malaria)和卵形疟原虫(P.ovale)阳性标本检测,其下限均为1 copy/μL,且整个PCR程序仅用时1 h 59 min;应用荧光定量PCR技术检测47例献血者全血标本,均为阴性;应用巢式PCR技术检测间日疟原虫和三日疟原虫的检测下限为102copy/μL,检测灵敏度明显低于荧光定量PCR检测方法。结论荧光定量PCR检测方法具有操作简单、快速、灵敏、经济等特点,通过针对本实验室的特定实验优化,更加适用于献血者疟原虫的快速大量筛查。

体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板

本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。

大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

目的 建立检测大鼠TGF- β1mRNA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT- PCR方法。方法 摸索SYBRGreenⅠ工作液的配制方法,筛选PCR反应液,优化反应中引物和MgCl2 的浓度,以actin为对照,建立大鼠TGF -β1mR NA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR方法并检测大鼠肾皮质TGF -β1mRNA表达水平。结果 SYBRGreenⅠ工作液,4 0倍水溶液稳定性好,最佳反应稀释度为1∶1 0 0 0 0。大鼠TGF β1表达水平的SYBRGreen荧光定量PCR方法,TGF- β1和actin的最佳MgCl2 反应浓度分别为2 5mM和3 5mM ,引物浓度分别为0 . 8μM和0. 5μM ,特异扩增产物的熔解温度分别为88 1和88 .6℃,因此选择在85℃时收集荧光信号。正常大鼠TGF- β1的Ct值在2 9 0 3,actin的Ct值在2 4 .86 ,扩增效率分别为0 . 995和1 . 0 8。结论 通过优化反应条件和特异性分析,成功地建立了特异、敏感的大鼠TGF- β1mRNASYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR。SYBRGreenⅠ荧光定量PCR快速、敏感、特异、经济,可以满足临床和科研的需要。

采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。

多重实时定量PCR检测BCR—ABL mRNA方法的建立

目的建立一种快速、可靠的实时定量PCR（RQ-PCR）检测BCR-ABL mRNA的方法。方法应用LightCycler技术，设计在同一PCR反应管内可扩增b3a2、b2a2、ela2几种常见的BCR-ABL转录本和b3a3、b2a3等少见转录本，并对RQ-PCR主要要素进行优化，评价优化后RQ-PCR的敏感性、特异性和可靠性。结果建立的RQ-PCR方法可检出10^3健康人单个核细胞中的1个K562细胞，最低可检出100个拷贝BCR—ABL分子。BCR—ABL和ABL的循环域值（C1）值（拷贝数）批内变异系数分别为0．68％（12．93％）和0．59％（8．60％），批间变异系数分别为1．14％（18．89％）和1．01％（12．72％）。结论RQ-PCR可作为评价慢性粒细胞白血病（CML）疾病进展、预后判断和骨髓移植后微量残留白血病监测的灵敏、可靠的方法。

PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值

目的:探讨PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值。方法:对1486例疑为泌尿生殖道感染患者分别采用PCR反向膜杂交法及荧光定量PCR(FQ-PCR)检测,并将检测结果与培养结果比较。结果:FQ-PCR检测CT、UU、NG阳性率高于培养法,比较差异有统计学意义(P<0.01);PCR反向膜杂交法与培养法及FQ-PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义;PCR反向膜杂交法、FQ-PCR检测敏感性比较差异无统计学意义,但PCR反向膜杂交法检测特异性高于FQ-PCR,比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:PCR反向膜杂交法筛查CT、UU、NG准确,快速,且筛查特异性高于FQ-PCR,值得临床推广适用。

实时荧光定量PCR技术检测食管鳞癌c-myc mRNA的表达

目的探讨c-myc mRNA表达与食管鳞癌发病的关系。方法采用实时荧光定量PCR法检测24例食管鳞癌患者食管鳞癌组织和正常食管鳞状上皮组织、癌旁食管鳞状上皮组织中c-myc mRNA的表达。结果食管鳞癌组织与癌旁食管鳞状上皮组织c-myc基因的表达量相近,二者均明显高于正常食管鳞状上皮组织(P<0.05)。结论c-myc基因在食管鳞状上皮癌变过程的早期阶段起重要作用。

实时荧光定量RT-PCR检测肝细胞肝癌中B-myb的表达及其临床意义

目的建立B-myb mRNA表达量检测的实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测肝细胞肝癌(HCC)中B-myb的表达并分析其临床意义。方法用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测70例HCC患者癌组织、癌旁肝组织及18例正常肝组织中B-myb mRNA的表达情况。结果B-myb mRNA在肝癌组织(0.0375±0.0168)及癌旁肝组织(0.0353±0.0128)中的表达水平明显高于在正常肝组织(0.0265±0.0099)中的表达水平(P<0.05),而在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。B-myb在人肝癌组织中的表达与临床分期、肝外转移及术后复发明显有关,而与门静脉癌栓、肿瘤个数、肿瘤直径、血清AFP水平及分化程度无明显关系。结论该方法克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点,为研究B-myb在HCC中的表达提供了定量方法。B-myb可能与肝癌的发生、发展有关。

针对Asia-1型FMDV的qRT-PCR终点法中和试验的建立及初步研究

为了缩短病毒中和试验(VNT)在口蹄疫病毒(FMDV)疫苗毒株选择以及病原检测中的时间,减少结果判断时人为因素的影响,试验采用qRT-PCR方法改进了传统的VNT,首先建立基于FMDV 3D序列的Taqman探针法qRT-PCR,之后使用FMDV Asia-1/JSL/06毒株感染IBRS-2细胞,提取不同时间收集的细胞病毒混合物的RNA进行qRT-PCR定量检测,获得FMDV Asia-1/JSL/06毒株在IBRS-2细胞中的病毒复制曲线,确定病毒复制的终点时间,即病毒中和试验中加入细胞维持液之后的第20小时,此时使用TRIzol裂解细胞并提取RNA进行qRT-PCR定量检测。以6作为拷贝浓度对数的临界值,拷贝浓度对数大于6的最低稀释度作为终点稀释度,建立了qRTPCR-VNT方法的终点稀释度判断标准,并应用该方法对19份阴性血清以及4份阳性血清进行qRT-PCR-VNT检测。结果表明:该方法获得的阴性、阳性结果与传统VNT检测获得的结果完全相符。说明该方法具有快速、有效、重复性好等优点,具有代替传统VNT的潜能。

快速检测洋葱伯克霍尔德菌巢式荧光定量PCR法建立

目的建立能直接快速应用于临床检测洋葱伯克霍尔德菌的巢式荧光定量PCR法。方法根据洋葱伯克霍尔德菌recA基因序列设计用于普通PCR扩增的外引物,同时设计用于荧光定量PCR的内引物。分别以洋葱伯克霍尔德菌等细菌的标准株为模板,以外引物进行第一轮PCR扩增;所得PCR产物为模板,以内引物进行染料法荧光定量PCR检测recA基因表达水平,评估巢式荧光定量PCR法的特异性。同时将洋葱伯克霍尔德菌的菌液和基因组DNA进行浓度梯度稀释,继续进行巢式荧光定量PCR,确定此方法的灵敏度。最后用巢式荧光定量PCR法和Vitek 2 Compact仪器分别鉴定35例临床标本,比较两者的检出能力。结果巢式荧光定量PCR法只针对洋葱伯克霍尔德菌有扩增曲线,而对其他菌株无检测信号。同时,巢式荧光定量PCR法的检测下限是1×10^1 CFU/mL的菌液和1×10^⁃5 ng/μL的基因组DNA,具有较高的灵敏度。巢式荧光定量PCR法能有效检测出14例临床标本存在洋葱伯克霍尔德菌感染(检出率为40.0%),而Vitek 2 Compact仪器仅检测出10例(检出率为28.6%),其中4例无法识别。结论巢式荧光定量PCR法具有有效、快速和直接应用于临床检测的优点,并且特异、灵敏和准确等特点,值得在临床推广。