利用等位基因特异扩增快速检测水稻香味基因

水稻香味受隐性基因控制,杂合材料不表现出香味,因此在香稻选育中需要寻找一种快速、简便的香味基因检测方法。本试验通过等位基因特异扩增(ASA)方法对9个香稻和3个非香稻品种(品系),以及3个香稻/非香稻组合的F1的香味基因,进行快速检测。结果显示,纯合非香稻可获得长度为585和355bp的两条带,纯合香稻可获得长度为577和257bp的两条带,杂种F1可获得长度为355、257和580bp左右的3条带。供试材料的分子检测结果与香味基因型完全相符,所用方法快速有效,可应用于香稻育种实践。

水稻香味基因分子标记的开发及应用

根据香稻材料在Badh2基因(甜菜碱醛脱氢酶基因)第7外显子的突变位点,设计了分子标记YY5-YY8用来区分这种突变类型的香稻材料。同时结合已报道的针对Badh2在第2、4、5外显子处突变设计的功能标记InDel-E2和FMbadh2-E4-5,对80份不同生态区香稻材料进行了标记检测。结果表明,26份材料属于第7外显子突变类型,37份材料属于第2外显子突变类型,无第4、5外显子突变类型材料。该研究构建了针对Badh2突变的新的分子标记YY5-YY8,并且鉴定了上述香稻材料的突变类型,为优质香稻分子育种奠定基础。

香稻的发展现状与研究进展

香米具有独特的香味及营养品质使其在国际稻米贸易中占有重要地位。近年来,随着分子技术的日益成熟及育种手段的不断提高,香稻的研究也从表型特征特性等深入到分子水平,育成的香稻品种也从单纯的常规品种到常规品种与杂交香型组合并存。文章综述了香稻的发展现状与研究进展,主要包括香稻的营养价值、香味的化学成分、香味的鉴定方法、香味的表达、香味的遗传、香味基因的分子标记与定位等,同时提出加强对香稻资源在特征特性、遗传多样性、配合力、分子标记、基因定位等方面的研究,以加快育成优质的香稻品种,满足社会对优质香稻的需求。

利用分子标记辅助选育香型优质粳稻新种质

为选育香型优质粳稻新种质,以粳稻‘武香075'为香味基因供体,优质水稻‘金丰'为受体,配制杂交组合,通过分子标记辅助选择和KOH香味检测法对杂交分离后代进行香味基因与香味鉴定筛选。经世代综合优良性状选择,最终选育获得优质高产香型粳稻种质纯合株系‘香粳1305'。经农业部稻米及制品质量监督检验测试中心检测,‘香粳1305'稻米品质优良,达到国标二等食用粳米标准。两年多点试验结果显示,‘香粳1305'实割产量9 487.50—9 685.50 kg/hm^2,较对照有显著或极显著增产,增产幅度为3.97%—7.23%,表现出较好的丰产性和稳产性。将分子标记辅助选择与常规育种手段相结合,可快速获得香味性状株系。

香型水稻的遗传和育种现状

香型水稻在国际稻米贸易市场上占有重要的地位,成为当今科研热门课题之一,而香味是香稻最重要的品质特性。本文概述了香型水稻的遗传机制、香味基因的鉴定及香味基因分子育种利用等方面内容,简要介绍了香型杂交稻不育系和恢复系选育的进展,并分析和阐述香型杂交稻的选育及推广应用方面的进展。最后,针对当前香型水稻存在的问题,就如何深入开展香型水稻相关研究进行展望。

豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用

【目的】香稻中香味的产生是由于水稻第8染色体上面Badh2基因的功能缺失而导致2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)前体物质的增多,进而2AP积累使稻米产生香气。【方法】本研究利用Badh2基因开发的7个功能标记,针对豫南地区16份香稻品种进行了检测与分析。【结果】4份香稻品种属于第2外显子突变类型,2份香稻品种属于第4~5外显子突变类型,5份香稻品种属于第7外显子突变类型;并没有发现Badh2基因启动子区及第12~14外显子突变类型的香稻品种。【结论】通过Badh2基因功能标记的检测与分析,本研究鉴定了豫南香稻品种对应的突变类型,为利用分子标记辅助选择培育优质香稻新品种奠定基础。

‘库尔勒香梨’PsPL基因的克隆与表达分析

【目的】分离和克隆‘库尔勒香梨’(Pyrus sinkiangensis Yu)果胶裂解酶(pectate lyase,PL)基因Ps PL,了解其在香梨果实不同时期转录水平上的表达差异,为香梨果实成熟软化机制研究提供理论依据。【方法】以‘库尔勒香梨’果肉组织为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术得到Ps PL c DNA全长序列,并利用生物信息学方法对其进行分析和功能预测。运用实时荧光定量(q RT-PCR)技术,分析Ps PL基因在香梨果实生长发育后期及货架期的表达特性和差异。【结果】Ps PL基因c DNA全长序列为1 245 bp,Gen Bank收录号为KJ547669,该基因共编码414个氨基酸,属于果胶裂解酶家族基因,与其他植物PL基因编码的氨基酸序列有较高的同源性,与苹果同源性最高,达到97%;Ps PL在不同时期香梨果实中的表达差异很大,在生长发育后期表达量很低,盛花后150 d表达量最高。【结论】同源克隆了‘库尔勒香梨’Ps PL基因,可能在该梨果实软化过程中起到作用。

广西特色香稻地方品种香味及其香味基因型的鉴定

【目的】鉴定广西地方香稻品种的香味及其香味基因型,为开发和利用广西香稻地方种质资源及选育优质特色香稻品种提供理论依据。【方法】将传统香味鉴定方法(KOH浸泡法和籽粒咀嚼法)与分子标记技术结合,对179份广西地方香稻种质资源的香味及其香味基因型进行鉴定。【结果】179份供试材料中,KOH浸泡法检测到具有香味的材料167份,籽粒咀嚼法检测到具有香味的材料124份。籽粒咀嚼法鉴定为香稻的品种中97.58%能用KOH浸泡法鉴定出香味,但KOH浸泡法鉴定为香稻的品种中仅72.46%能用籽粒咀嚼法鉴定出香味。利用分子标记法能检测到等位基因的有71份,占供试材料总数的39.66%,主要以InDel7和InDel4-5等位基因为主,其中仅1份检测到InDel2等位基因,40份检测到InDel7等位基因,37份检测到InDel4-5等位基因,未检测到InDel13等位基因,但有7份同时检测到InDel7等位基因和InDel4-5等位基因。71份能检测到等位基因的材料中有69份被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鉴定为香稻品种,正确率达97.18%。在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鉴定为香稻的121个品种中,香味表型明确,但仅有55个品种能检测到等位基因,检出率为45.45%。来自百色市的供试材料中能检测到等位基因的品种占该市香稻品种总数的53.19%,含有InDel2、InDel7和InDel4-5等位基因型,但以Indel7等位基因型为主;来自河池市的供试材料中能检测到等位基因品种占该市香稻品种总数的比例最高,达64.10%,但只检测到2种基因型,以Indel4-5等位基因型为主;柳州市及其他市能检测到等位基因的比例远低于百色市和河池市。【结论】广西香稻地方品种具有较强的地域特色,不同地区的香稻香味等位基因存在明显差异,且可能存在已报道的等位基因之外的香味基因或香味等位基因,仅用4个已报道的等位基因不足以检测出全部的香稻品种,应将分子标记法与传统鉴定方法相结合,才可更准确鉴定出香稻品种。

利用分子标记辅助选择回交转育培育早粳稻空育131(fgr)导入系

为了改良综合性状优良的早粳稻空育131的香味性状,培育水稻空育131(fgr)导入系,以非香米空育131为受体亲本,香米稻花香2号为香味基因fgr供体亲本,利用功能性SNP-fgr标记鉴定选择香味基因,同时利用34个双亲间具有多态性的SSR标记进行背景选择,经过3次回交转育创制了背景恢复率达100%的候选水稻空育131(fgr)导入系。对候选水稻空育131(fgr)导入系的农艺性状、抗稻瘟病性、耐冷性、抗倒伏性及香味性状进行鉴定,培育出了除香味以外其他性状与空育131相似或相同的早粳稻空育131(fgr)导入系。水稻空育131(fgr)导入系可以在黑龙江省香米水稻生产中示范试种。

根癌农杆菌介导水稻香味基因的遗传转化

以日本腈为材料,研究根癌农杆菌介导水稻香味基因的遗传转化。研究结果表明,通过农杆菌介导的方法将水稻香味基因badh2导入了水稻粳稻品种日本腈中,并获得转基因植株。通过PCR检测,初步证明外源基因badh2已整合到日本腈基因组中。

‘库尔勒香梨’脱萼组与宿萼组样品差异表达基因的筛选

【目的】系统研究‘库尔勒香梨’脱萼组和宿萼组花器官的转录组表达情况,筛选2者之间的差异表达基因,为进一步阐明‘库尔勒香梨’萼片脱落与宿存分子机理奠定基础。【方法】采用Illumina高通量测序技术对‘库尔勒香梨’脱萼组和宿萼组代表样品进行测序,利用生物信息学方法筛选2者的差异表达基因和进行功能基因预测。【结果】Trinity法拼接后得到48 894条unigenes序列,从中选取了2组样品中共表达和单独表达的SPL转录因子进行了功能探究,发现3条unigenes可能与萼片发育有关。筛选的差异表达基因获得了Gene Ontology和KEGG数据库的注释,涉及植物激素信号转导、光合代谢、苯丙氨酸代谢、芳香族化合物合成、细胞发育等与萼片发育相关过程。【结论】筛出了2组样品的差异表达基因,获得了与萼片发育相关的基因及其对应的功能注释,为今后进一步研究‘库尔勒香梨’萼片脱落与宿存分子机理奠定了良好基础。

抗条纹叶枯病基因qSTV11^(KAS)新分子标记建立及23种香型水稻qSTV11^(KAS)基因的调查分析

根据抗条纹叶枯病品种"秀水123"与易感品种"日本晴"抗条纹叶枯病基因qSTV11^(KAS)在距离起始密码子第一个脱氧核苷酸+640处的差异,建立了一种能够更便于区分qSTV11^(KAS)基因型的CAPS(BtgⅠ)分子标记及检测方法,并对23种香型水稻的qSTV11^(KAS)基因进行调查分析.结果表明,CAPS(BtgⅠ)分子标记可以用来区别水稻是否含有抗条纹叶枯病基因qSTV11^(KAS)及基因型;在检测的23种香稻中,仅有"中香1号"、"青香软粳"和"泰国香稻"3种水稻含有与"秀水123"相同的qSTV11^(KAS)抗性基因.本研究为今后分子标记辅助选育抗条纹叶枯病香型水稻新品种和筛选条纹叶枯病新的抗性基因资源应用奠定了基础.

BADH引物检测水稻香味基因的研究

[目的]为了检测水稻中的香味基因,为其在香稻选育中的应用提供依据。[方法]从泰国香稻的回交后代材料BC3F2和中国的香稻中提取DNA后,加入BADH引物进行PCR扩增,并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测香味基因。同时,对含香味基因的单株利用KOH溶液作叶片香味鉴定,并比较两种检测结果。[结果]电泳结果表明,94份样品中有32份样品含有纯合的香味基因,19个样品为香味基因的杂合体,与KOH溶液法检测香味的结果一致。BADH引物PCR扩增结果表明,香味来源于新香B的后代材料能产生明显的DNA扩增带,其香味基因与KDLM105以及Basmati香稻品种的香味基因均位于第8染色体上,属于等位基因。[结论]在香稻品种选育中,利用BADH引物能准确检测出含香味基因的植株,显著地缩短香稻品种育成的年限。

库尔勒香梨自交不亲和SFBB-γ基因F-box区和可变区V3 RNAi表达载体的构建及遗传转化

目的为在分子水平应用RNAi(RNA interference)技术调控梨自交不亲和性状,培育自交亲和梨品种。方法基于本实验室获得的库尔勒香梨(Pyrus bretschneideri Rehd)自交不亲和品种花粉决定子SFBB-γ基因c DNA全长序列,选取SFBB-γ基因F-box区和可变区V3分别设计141 bp和120 bp的片段作为干扰序列,以棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR (Fusion PCR)构建SFBB-γ基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihpRNA),酶切后与pCAMBIA1304植物表达载体相连,构建SFBB-γ基因RNAi表达载体并转化至农杆菌GV3101中。利用叶盘转化法转化到库尔勒香梨无菌叶片中,用GUS组织化学染色法鉴定侵染叶片。测序结果表明干扰F-box区获得的ihpRNA臂长为141 bp,茎环253 bp;干扰可变区V3获得的ihpRNA臂长为120 bp,茎环253 bp。结果说明SFBB-γ基因F-box区和V3区的ihpRNA结构融合成功。通过双酶切检验及PCR证实,SFBB-γ基因F-box区和V3区的RNAi表达载体p CAMBIA1304-RNAi-SFBB构建成功; PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌GV3101中,GUS染色检验获得蓝色,目的基因已整合进入库尔勒香梨叶片中。结论成功构建库尔勒香梨SFBB-γ基因F-box区及可变区V3的RNAi表达载体,为诱导香梨SFBB-γ基因转录后基因沉默及培育自交亲和梨品种提供参考。

水稻香味的遗传研究进展

香米在国际稻米贸易市场上占有重要的地位,成为当今科研热门课题之一,而香味是香稻最重要的品质特性.普遍认为香味是单基因隐性遗传的,由第8染色体编码BADH2的基因碱基部分缺失而产生,香味表达是基因与环境相互作用的结果.本文主要综述了近年来水稻香味的研究进展,主要包括香味的类型、香味的主要化学成分—2-乙酰-1-吡咯啉及其遗传与表达、香味常用的鉴定方法以及香味基因的分子标记与定位等,并对存在的问题进行了分析与展望.

一种新的水稻香味基因功能标记的开发与应用

香味是影响稻米品质的一个重要性状,Badh2基因突变是水稻产生香味的主要原因,水稻香味产生主要有Badh2基因第2、4、5、7、8外显子突变类型,其中研究最多的是第7外显子突变类型。为了提高水稻香味性状检测的准确性、安全性和效率,本研究根据水稻Badh2基因突变(第7外显子8 bp缺失、3 bp突变)的序列设计开发了3条分子标记引物,分别命名为Fgr-FF、Fgr-NF和Fgr-R,利用该三引物分子标记法可准确扩增出Badh2第7外显子突变基因,并鉴定其纯杂合情况。本标记利用PCR扩增中引物5’端保守性差的特点,将31 bp外源DNA序列添加至Fgr-NF引物的5’端,将Badh2基因第7外显子突变类型的非香型和香型特征条带差异由8bp扩大至41bp,通过琼脂糖凝胶就能准确、清晰、快速地检测出水稻植株中香味基因的纯合、杂合和无3种基因型。利用该三引物分子标记的PCR扩增结果表明:该标记在香型水稻中扩增出一条115 bp的特征条带,在非香型水稻中扩增出一条156 bp的特征条带,而在杂合型水稻中能同时扩增出115bp和156bp两条特征条带。本研究利用该三引物功能标记对30个水稻品种香味基因型进行检测,结果检测出香味纯合植株9株,非香纯合植株20株,该检测结果与2种表型鉴定结果相符;杂合植株1株,这是由于水稻香味基因是隐性基因,杂合型水稻叶片表现为非香,部分籽粒表现为香;使用传统的香味鉴定方法容易对香味杂合型水稻产生误判,而通过基因检测结果和表型验证表明新开发香味三引物功能标记准确可靠;利用三引物功能标记对94个F_(2)代单株的香味基因进行检测,结果检测出香味纯合植株23株,非香纯合植株44株,杂合植株27株,符合1∶2∶1孟德尔遗传的分离比例。该研究既避免了水稻香味鉴定与检测中KOH法和咀嚼法的主观误差,也解决了聚丙烯酰胺凝胶电泳的毒性强、耗时长等问题,大幅度地提高了香型水稻品种的选择效率。

利用CRISPR/Cas9技术创制香稻

【目的】随着人们生活水平的不断提高,具有香味的优质稻米日渐受到消费者的欢迎。水稻的香味性状主要受第8染色体上的BADH2基因控制,该基因突变造成稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉的积累而产生香味,加速香稻培育的进程。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以适宜江西种植的粳稻台南11为研究材料,在BADH2基因的第3外显子处设计靶位点创制BADH2基因突变株系,利用潮霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植株,经测序和PCR分析获得无转基因成分的稳定突变株系。利用气相色谱质谱联用仪测定野生型和T3代突变体材料中2-乙酰-1-吡咯啉的含量。考查分析野生型和T3代突变体材料的产量及品质。【结果】成功获得了BADH2基因突变株系,对这些株系进行鉴定分析,获得4种突变类型,其中插入突变1种,缺失突变3种;突变体材料中的2-乙酰-1-吡咯啉较野生型含量均显著提高;与野生型相比,突变体材料中的有效分蘖数、每穗总粒数、结实率等产量性状呈现显著性差异,产量平均减少8.7%;突变体材料中的蛋白质含量、整精米率、垩白度、长宽比等品质相关性状与野生型相比呈现显著性差异,品质在一定程度上有所提高。【结论】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功对水稻中的BADH2基因进行了敲除,显著提高了水稻中香味物质的积累,缩短了培育香稻的时间,为进一步选育香稻提供理论技术和材料支撑。

IAA及其运输载体PIN对库尔勒香梨萼片脱落与宿存影响的研究

目前,我国库尔勒香梨栽培面积逐步增大,产量大幅度升高,脱萼果减少,果肉质地变硬,石细胞含量增多,可食比例减少,风味口感下降,品质明显下降,严重影响香梨的销售。影响库尔勒香梨果萼脱落或宿存的因素很多。本文主要从香梨萼片发育、生长素对香梨萼片脱落或宿存的影响以及从分子层面阐述生长素极性运输载体PIN蛋白和该蛋白如何调控生长素运输与脱落,对提高香梨果萼脱落率以及改善果实品质及外观有重要意义。

标记辅助选择结合花药培养创制优异香型粳稻种质

香米是较受市场青睐的稻米类型,在优质香稻品种中,‘稻花香2号’久负盛名,但其产量较低、稻瘟病抗性较弱;因此,通过对‘稻花香2号’的遗传改良,育成高产、高抗稻瘟病类型的香型种质意义重大。本研究以‘稻花香2号’为香型badh2基因的供体亲本,以携带稻瘟病抗性基因Pita、Pib及Pid2的粳稻种质‘盐粳144’为背景亲本,开展了优异香型种质培育工作。利用标记辅助选择结合花药培养技术,于3年内,成功创制同时聚合badh2、Pita、Pib及Pid2基因的改良系4份;香味、稻瘟病抗性及产量和品质鉴定表明,4份改良系的2-AP含量均接近‘稻花香2号’水平,而稻瘟病抗性和产量显著优于‘稻花香2号’,但食味品质相比于‘稻花香2号’仍存在差距。最终,获得一份产量、抗性及品质综合性状较优的改良系-3,参加辽宁省优质食味组区域试验。上述结果为多基因聚合育种及优质香型稻培育提供了技术支撑及优异种质。

四引物扩增受阻突变体系PCR检测水稻香味基因badh2方法的优化

badh2是控制水稻香味的主效基因,其与等位非香基因Badh2功能差异主要在于第七外显子上的8 bp缺失及3个SNP,开发其易于分辨且稳定的功能标记将有助于香稻分子育种。本研究基于四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra Primer Amplification Refractory Mutation System PCR,Tetra-primer ARMS PCR)原理,在功能差异位点外侧两引物一致的情况下,分别设计与badh2和Badh2完全匹配的5'端添加错配碱基的靶引物。结果表明,经1%的琼脂糖凝胶电泳后,由完全匹配引物组成的PCR体系基本能分辨badh2/Badh2基因型,但目标条带较模糊;而引物中5'端引入错配碱基的PCR体系能产生更明晰、易于分辨的目标条带。本研究将有助于香稻分子育种及为其他类似分子标记的优化提供借鉴。