基于核酸杂交反应的荧光生物传感器的制备及在黄曲霉毒素B_1检测中的应用

采用核酸适配体作为特异性识别元件,SYBR Green I(SGI)荧光染料为信号输出单元,构建了黄曲霉毒素B_1(AFB_1)生物传感器,并对试验条件进行了优化。优化的试验条件如下:适配体互补链与适配体的物质的量比为1.5,SGI加入量为10μL,适配体双链与SGI的作用时间为2 min,适配体与AFB_1作用时间为14 min。结果表明,在AFB_1质量浓度为0.1~1 000μg·L^(-1)时,荧光强度变化量与其质量浓度对数呈线性关系,检出限(3S/N)为0.081μg·L^(-1)。对实际玉米样品进行加标回收试验,回收率为95.2%~105%,测定值的相对标准偏差(n=7)均小于6.0%。与其他适配体传感器进行比较,该方法所构建的荧光适配体传感器对AFB_1的检测具有操作简便、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点,适合现场快速测定。

水稻维生素B_1合成相关基因OsTHIC的功能研究

【目的】维生素B_(1)(vitamin B_(1), VB_(1))是生物所必需的微量元素,其作为多个酶的辅因子,参与重要的细胞代谢途径,而水稻中维生素B_(1)合成途径还有待深入研究。本研究旨在解析水稻维生素B_(1)合成相关基因OsTHIC的生物学功能。【方法】综合运用诱变技术、色素测定、Mutmap+、基因编辑及非靶向代谢组分析等手段克隆目的基因并解析其功能。【结果】从EMS诱变的水稻突变体库中发现一个心叶白化致死突变体wll1(white leaf and lethal 1)。wll1从四叶期开始出现心叶白化表型,白化表型逐渐扩展到其他叶片并导致幼苗死亡。与野生型相比,wll1的叶绿素含量与类胡萝卜素含量显著降低。利用Mutmap+及基因编辑技术,确定目的基因为维生素B_(1)合成相关基因OsTHIC。OsTHIC在叶片具有较高表达量,OsTHIC蛋白定位于叶绿体。wll1及OsTHIC的敲除突变体中维生素B_(1)含量均显著低于野生型,外施维生素B_(1)可以恢复wll1的突变表型。外施维生素B_(1)及OsTHIC突变均会影响维生素B_(1)合成相关基因的表达。非靶向代谢组测序分析表明,野生型与wll1差异代谢物在氨基酸的生物合成、辅因子的生物合成、ABC转运器及氨酰基-tRNA的生物合成等方面显著富集。【结论】OsTHIC通过调控维生素B_(1)含量,参与氨基酸合成等代谢过程,在水稻生长发育过程中发挥重要作用。

基于适配体亲和磁珠的黄曲霉毒素B_1单样本前处理试剂盒的制备及应用

黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)适配体共价偶联于磁珠表面制备适配体亲和磁珠(aptamer affinity magnetic beads,AAMB),将AAMB、孵育液、洗涤液和洗脱液预封装于试剂条中开发了AFB_1单样本前处理试剂盒,借助真菌毒素全自动净化仪实现了AFB_1前处理的自动化,使用超高效液相色谱仪对洗脱液中AFB_1的含量进行测定。通过优化磁珠粒径、适配体间接臂长度、适配体亲和磁珠用量、孵育液体积确定了AAMB的制备条件以及AFB_1单样本前处理试剂盒的使用条件,对比了手动和自动两种前处理方式下AAMB回收率的差异。在优化条件下,AFB_1的检出限(limit of detection,LOD)为0.6 ng/mL,玉米和小麦中低、中、高三个水平的加标回收率在92.8%~110.1%之间,日内精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)小于5.1%,日间精密度的RSD为6.7%,具有良好的灵敏度、准确性和重复性;粮油基质(玉米、糙米、花生油和花生酱)中AFB_1成分国家有证标准物质的测定结果在其扩展范围内,具有良好的基质适用性。开发的单样本前处理试剂盒借助真菌毒素全自动净化仪仅需一步操作即可在20 min内自动完成10个样品的前处理,具有时间短、通量高、批次间差异小的优点,在真菌毒素定量检测方面具有良好的应用前景,为开发针对其它靶标的自动化前处理方法奠定了基础。

基于复合纳米材料比色/荧光双信号的黄曲霉毒素B_1检测

以黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)为检测目标物,使用二氧化硅纳米颗粒为载体富集谷胱甘肽和黄曲霉毒素适配体制备识别探针,二氧化锰纳米颗粒与石墨烯量子点偶联的复合纳米材料为底物,通过谷胱甘肽与底物的反应构建了一种比色和荧光双模信号输出的高灵敏便携式检测平台。在优化条件下,对本方法的检测性能及特异性进行研究,得到比色信号的回归方程为ΔA=-0.275-0.021lg C,检出限为2.732×10^(-12) g/m L;荧光信号的回归方程为ΔF=928.733+71.779lg C,检出限为1.667×10^(-12) g/m L,两种方法都具备良好检测特异性。将该方法用于牛奶、大米、麦片、酱油和白醋5种实际样品中AFB_1的检测,并与传统方法进行对比,本方法结果具有较高的准确度。

伏马菌素B_(1)脱毒研究进展

伏马菌素B_(1)(FB_(1))是由镰刀菌产生的水溶性代谢产物,存在于镰刀菌污染了的谷物、油料作物、坚果、饲草和饲料中,是常见的真菌毒素之一。FB_(1)会对神经系统、呼吸系统、消化系统和生殖系统产生不同毒性作用,给农牧业造成不可估量的经济损失。如何对FB_(1)进行脱毒,以降低其毒性作用,是目前研究的热点。因此,本文对FB_(1)的物理脱毒、化学脱毒、生物脱毒及其应用进行综述,重点对常用于FB_(1)生物脱毒的菌株和酶及其脱毒效果、脱毒机制进行了深入探讨,以期为提高FB_(1)脱毒效率和开发新的FB_(1)脱毒方法提供参考和思路。

维生素B_(6)对动脉粥样硬化小鼠血管内皮损伤的影响及作用机制

目的探讨维生素B_(6)(VB_(6))对动脉粥样硬化(AS)小鼠血管内皮损伤的影响及作用机制。方法将36只ApoE-/-小鼠随机分为对照组、AS组、VB_(6)组、AS+LiCl组、AS+VB_(6)组和AS+VB_(6)+LiCl组,每组6只。AS组、AS+LiCl组、AS+VB_(6)组和AS+VB_(6)+LiCl组小鼠高脂饮食12周建立AS模型;对照组和VB_(6)组小鼠常规饮食、正常饮水12周。12周后,对照组小鼠常规饮食,每日给予和VB_(6)组等体积的生理盐水灌胃;VB_(6)组小鼠常规饮食,每日灌胃给予VB_(6)(50 mg·kg^(-1));AS+LiCl组小鼠继续给予高脂饮食,每日灌胃给予LiCl(1 mg·kg^(-1));AS+VB_(6)组小鼠继续给予高脂饮食,每日灌胃给予VB_(6)(50 mg·kg^(-1));AS+VB_(6)+LiCl组小鼠继续给予高脂饮食,每日灌胃给予VB_(6)(50 mg·kg^(-1))和LiCl(1 mg·kg^(-1));6组小鼠均干预4周。干预结束后,采用酶联免疫吸附试验检测各组小鼠血清中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性。苏木精-伊红染色观察各组小鼠胸主动脉组织形态,并计算AS斑块面积占血管总面积的百分比。离体血管环实验检测胸主动脉舒张率。免疫组织化学法检测胸主动脉中钠氢交换蛋白1(NHE1)表达。结果与对照组相比,AS组小鼠血清中NO水平和SOD活性显著下降,MDA水平显著升高(P<0.05);VB_(6)组与对照组小鼠血清中NO、MDA水平和SOD活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。与AS组相比,AS+VB_(6)组小鼠血清中NO水平和SOD活性显著上升,MDA水平显著下降(P<0.05);AS+LiCl组、AS+VB_(6)+LiCl组与AS组小鼠血清中NO、MDA水平和SOD活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。与AS+VB_(6)组相比,AS+VB_(6)+LiCl组小鼠血清中NO水平和SOD活性显著下降,MDA水平显著升高(P<0.05)。AS组小鼠AS斑块面积占血管总面积的百分比显著高于对照组(P<0.05);VB_(6)组与对照组小鼠AS斑块面积占血管总面积的百分比比较差异无统计学意义(P<0.05)。AS+VB_(6)组小鼠斑块面积占血管总面积的百分比显著低于AS组(P<0.05);AS+LiCl组、AS+VB_(6)+LiCl组与AS组小鼠AS斑块面积占血管总面积的百分比比较差异无统计学意义(P<0.05)。AS+VB_(6)+LiCl组小鼠AS斑块面积占血管总面积的百分比显著高于AS+VB_(6)组(P<0.05)。对照组小鼠血管内皮光滑平整,细胞排列整齐有序;AS组、AS+LiCl组和AS+VB_(6)+LiCl组小鼠的血管组织结构紊乱、血管内皮粗糙;VB_(6)组和AS+VB_(6)组小鼠的血管壁结构正常、血管内皮光滑、细胞排列有序。AS组小鼠乙酰胆碱(Ach)诱导的胸主动脉舒张率显著低于对照组(P<0.05);VB_(6)组与对照组小鼠Ach诱导的胸主动脉舒张率比较差异无统计学意义(P>0.05)。AS+VB_(6)组小鼠Ach诱导的胸主动脉舒张率显著低于AS组(P<0.05);AS+LiCl组、AS+VB_(6)+LiCl组与AS组小鼠Ach诱导的胸主动脉舒张率比较差异无统计学意义(P>0.05)。AS+VB_(6)+LiCl组小鼠Ach诱导的胸主动脉舒张率显著高于AS+VB_(6)组(P<0.05)。6组小鼠硝普钠诱导的胸主动脉舒张率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。AS组小鼠胸主动脉中NHE1蛋白表达量百分比显著高于对照组(P<0.05);VB_(6)组与对照组小鼠胸主动脉中NHE1蛋白表达量百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。AS+VB_(6)组小鼠胸主动脉中NHE1蛋白表达量百分比显著低于AS组(P<0.05);AS+LiCl组、AS+VB_(6)+LiCl组与AS组小鼠胸主动脉中NHE1蛋白表达量百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。AS+VB_(6)+LiCl组小鼠胸主动脉中NHE1蛋白表达量百分比显著高于AS+VB_(6)组(P<0.05)。结论VB_(6)可通过抑制NHE1蛋白的表达来改善AS小鼠的血管内皮损伤。

基于纳米抗体的可再生免疫亲和柱结合高效液相色谱-串联质谱法测定玉米中的黄曲霉毒素B_(1)

目的研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxinB_(1),AFB_(1))纳米抗体的表达产量的影响因素,开发具有可再生性的AFB_(1)免疫亲和柱,构建免疫亲和处理-高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定玉米中AFB_(1)污染的分析方法。方法研究诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度等对AFB_(1)纳米抗体表达量的影响,比对验证AFB_(1)纳米抗体可再生免疫亲和柱的耐受性和可再生使用次数。使用70%甲醇水溶液提取玉米样品中AFB_(1),提取液通过免疫亲和柱净化富集后进行HPLC-MS/MS检测,最后进行方法学验证并应用到实际样品检测。结果诱导AFB_(1)纳米抗体表达的最优条件分别为诱导温度16℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间14 h,在最优条件下产量可达7.8 mg/L。AFB_(1)纳米抗体具有良好灵敏度、亲和性、特异性和甲醇耐受性,制备的AFB_(1)免疫亲和柱具有极好的可再生性,重复使用150次以上,对AFB_(1)回收率仍可达80%以上。同时,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS,在0.1~100.0μg/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.014μg/L,定量限为0.047μg/L。在3个不同加标浓度下,回收率在92.0%~104.1%,变异系数小于3.9%。结论本研究开发的AFB_(1)纳米抗体免疫亲和柱表现出优秀的再生性和高特异性,节约了检测成本,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS检测方法操作简便、回收率高、结果准确,适用于实际玉米样品中AFB_(1)的含量测定。

黄曲霉毒素B_(1)降解菌株的分离鉴定、发酵条件的优化及活性组分分析

为筛选出一株高效降解黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))的菌株,选取土壤为菌株来源,进行富集培养,经过以香豆素为唯一碳源的初筛和添加AFB_(1)的复筛后,对筛选得到的各菌株进行16S rDNA鉴定,比对其测序结果,选取降解AFB_(1)最高的菌株,探究发酵时间、发酵温度、初始pH、接种量、培养基对菌株降解AFB_(1)的影响规律,通过正交试验优化发酵条件,并对降解方式进行初步探索。结果表明:经过初筛和复筛得到7株能够降解AFB_(1)的菌株,经鉴定均为伯克霍尔德菌属,其中Burkholderiasp.D6的AFB_(1)降解率最高;最优发酵条件为以LB培养基为发酵培养基、发酵时间84h、发酵温度37℃、初始pH 7.0、接种量10%,在此条件下Burkholderiasp.D6对AFB_(1)的降解率为(87.91±2.32)%;初步判断降解AFB_(1)的活性组分是蛋白质或者酶。综上,通过筛选得到了一种能够高效降解AFB_(1)的菌株,蛋白质或酶参与了AFB_(1)的降解。

益生菌对黄曲霉毒素B_(1)的降解作用及其在家禽生产上的应用

黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)主要存在于污染粮油及其制品中,常见的有AFB_(1)、AFB_(2)、AFG_(1)和AFG_(2)四种类型,以黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))毒性最强,对全球农业和食品安全造成极大危害。目前,常用的缓解AFB_(1)毒性的方法包括物理法、化学法和生物法,其中生物脱毒法中,益生菌作为绿色无污染的添加剂成为研究的热点。本文综述了黄曲霉毒素对家禽的危害,列举了对黄曲霉毒素具有降解作用的益生菌,阐述了益生菌的解毒机制以及在禽类生产中的应用,以期为利用益生菌降解AFB_(1)的研究及应用提供借鉴和指导。

姜黄素在肉鸡生产中的研究与应用

姜黄素(CUR)是一种天然化合物,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、降脂和调节免疫等多种药理作用,可以作为一种新型的饲料添加剂在畜禽饲料中应用。在饲粮中添加适量CUR可以提高肉鸡的生产性能,增强免疫力,改善畜产品品质,减轻黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))导致的肉鸡肝毒性。文章就CUR的生理功能以及其对肉鸡生产性能、肉品质、免疫功能、抗氧化能力、脂质代谢和AFB_(1)干预的影响进行阐述,以期为CUR作为新型饲料添加剂在肉鸡生产中的推广及合理应用提供参考。

利用时间分辨荧光免疫层析法同时定量检测玉米中的伏马毒素B_(1)、B_(2)和B_(3)

建立了一种可同时定量检测玉米中伏马毒素B_(1)、B_(2)和B_(3)的时间分辨荧光免疫层析方法。利用活化酯法制备时间分辨荧光微球和伏马毒素抗体的偶联物,将伏马毒素抗原包被到硝酸纤维素膜上作为T线,通过优化不同T线包被条数,最终建立伏马毒素竞争性免疫层析方法。并对所建立方法的灵敏度、特异性、准确度、精密度和与国标方法分析结果的相关性进行评价。包被两条T线建立的检测方法检出限为107.68~168.28μg/kg,定量限为283.46~444.63μg/kg;与伏马毒素B_(1)、伏马毒素B_(2)和伏马毒素B_(3)的交叉反应率分别为100%、85.59%和72.72%,与其它5种常见的真菌毒素均无明显交叉;加标回收率范围88.37%~117.42%,变异系数小于10%;该方法与国标方法GB 5009.240-2016中规定的免疫亲和柱净化-高效液相色谱法(IAC-HPLC)检测结果的符合度在92.17%~107.21%之间。建立的时间分辨荧光免疫层析检测方法能满足对玉米中伏马毒素B_(1)、B_(2)和B_(3)的现场快速定量检测。

桦褐孔菌提取物对黄曲霉素B_(1)暴露小鼠肝损伤的缓解作用

[目的]探究桦褐孔菌提取物(IOE)对黄曲霉毒素B1(AFB_(1))暴露小鼠肝损伤的保护作用及机制。[方法]选取30只6周龄、体重相近的SPF级雄性C57BL/6小鼠,随机分为5组,对照组连续灌胃蒸馏水10 d;AFB_(1)组第1~7天连续灌胃蒸馏水,第8~10天连续灌胃2 mg/kg AFB_(1);不同浓度IOE组第1~7天分别连续灌胃25、50和100 mg/kg IOE,第8~10天各组均连续灌胃2 mg/kg AFB_(1),灌胃剂量均为0.2 mL,每天1次。试验结束后对小鼠称重并采集血液、肝脏组织,统计肝脏指数;通过苏木精-伊红(HE)染色观察肝脏组织病理变化;利用流式细胞仪分析肝脏细胞凋亡情况。通过细胞毒性试验,筛选AFB_(1)诱导AML12细胞损伤最适条件,并以此建立肝损伤模型,给予不同浓度IOE进行干预,利用CCK-8法测定细胞活力,确定IOE防治AFB_(1)诱导AML12细胞损伤的剂量范围。使用ELISA法检测血清和细胞中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;利用实时荧光定量PCR检测肝脏和AML12细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因mRNA表达量;采用Western blotting检测肝脏和AML12细胞中NLRP3、Bax和Bcl-2蛋白表达量。[结果]与对照组相比,AFB_(1)组肝细胞排列紊乱、细胞肿胀,细胞凋亡率极显著升高(P<0.01);血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均极显著升高(P<0.01);肝脏中TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3和Bax基因表达量均极显著升高,Bcl-2基因表达量极显著降低(P<0.01);NLRP3和Bax蛋白水平极显著升高,Bcl-2蛋白水平极显著降低(P<0.01)。与AFB_(1)组相比,不同浓度IOE组小鼠炎性细胞浸润减少,细胞排列整齐,细胞凋亡率极显著降低(P<0.01);血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量极显著降低(P<0.01);肝脏TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3和Bax基因mRNA表达量极显著降低,Bcl-2基因表达量极显著升高(P<0.01);NLRP3和Bax蛋白水平均极显著降低,Bcl-2蛋白水平极显著升高(P<0.01)。细胞毒性试验结果显示,AFB_(1)诱导AML12细胞损伤最适条件为10μg/mL AFB_(1)作用24 h, IOE防治AFB_(1)诱导AML12细胞损伤的浓度梯度为1.5、3、6μg/mL。体外试验结果显示,AML12细胞中各炎性因子分泌、凋亡相关基因及蛋白表达量变化趋势与体内试验结果均一致。[结论]IOE可通过调节NLRP3、Bax和Bcl-2表达抑制炎性因子分泌,降低细胞凋亡,进而缓解AFB_(1)暴露引起的小鼠肝脏损伤。

白藜芦醇对黄曲霉毒素B_(1)致兔肾脏损伤的保护作用

【目的】探究白藜芦醇(resveratrol,Res)对黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))致兔肾脏损伤的保护作用。【方法】将21只40日龄的家兔随机分为3组,每组7只,分别为对照组、AFB_(1)组和AFB_(1)+Res组,其中对照组饲喂基础饲粮,AFB_(1)组饲喂含0.3 mg/kg BW AFB_(1)的基础饲粮、AFB_(1)+Res组饲喂含0.3 mg/kg BW AFB_(1)和30 mg/kg BW Res的基础饲粮,试验期21 d。试验结束后观察家兔肾脏组织病理变化,检测血清中肌酐(creatinine,CRE)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)和尿酸(uric acid,UA)含量,检测肾脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量/活性。【结果】与对照组相比,AFB_(1)组家兔肾脏可见肾小囊腔扩张、肾小管上皮细胞排列紊乱、细胞核模糊和脱落,且肾脏中糖原沉积增多;血清中CRE、BUN和UA含量均显著升高(P<0.05);肾脏组织中GSH-Px、SOD活性和T-AOC均显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05)。与AFB_(1)组相比,AFB_(1)+Res组家兔肾脏组织结构损伤得到缓解,且糖原沉积减少;血清中CRE、BUN和UA含量均显著降低(P<0.05);肾脏组织中GSH-Px、SOD活性和T-AOC均显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。【结论】饲料中添加Res可以通过提高兔肾脏抗氧化能力、调节氧化应激水平而有效缓解AFB_(1)引起的兔肾脏损伤。

伏马毒素B_(1)对棉铃虫生长发育、解毒酶系和抗氧化酶系的影响

玉米耕作模式的转变,使伏马毒素B_(1)成为棉铃虫需要面对的新环境因素。为明确棉铃虫对这种新环境因素的适应机制,本研究测定了饲喂伏马毒素B_(1)后棉铃虫的生长发育情况及体内解毒酶、抗氧化酶活性。自棉铃虫3龄幼虫连续摄入伏马毒素B_(1)后,幼虫期7 d体质量增长量、产卵量及孵化率较对照组有不同程度的降低,棉铃虫化蛹之前的发育历期较对照组缩短,而蛹期却延长。不同浓度的伏马毒素B_(1)胁迫不同时间后棉铃虫体内酯酶的活性均显著升高,细胞色素P450和谷胱甘肽S-转移酶的活性有不同程度的变化;抗氧化酶系中,过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性在伏马毒素B_(1)胁迫1 d时较对照组均显著升高,过氧化物酶活性仅在高剂量处理5 d时显著升高。棉铃虫伏马毒素B_(1)耐受品系中羧酸酯酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性较敏感品系显著升高,分别上升75.40%、50.74%、117.21%。综上,摄入伏马毒素B_(1)后棉铃虫的生长发育受到影响,棉铃虫通过激活酯酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等应对伏马毒素B1的胁迫。

伏马菌素B_1免疫检测方法的研究

本研究建立了用于检测粮食、饲料中伏马菌素Ｂ１（ＦＢ１）的快速、灵敏、简便的免疫检测方法—建立在单克隆抗体基础上的直接竞争性酶联免疫吸附测定方法（ＤＣ—ＥＬＩＳＡ法）；其最低检出浓度为１０ｎｇ／ｍｌ，线性范围在１０ｎｇ～５μｇ／ｍｌ。对新疆、安徽、黑龙江、哈尔滨四省市玉米样品中的ＦＢ１含量进行了测定，结果表明１５６份样品中有３４份检出ＦＢ１，阳性率为２１．７９％，含量在０．１８～３１．３２μｇ／ｇ范围内，平均含量为１２．０４μｇ／ｇ。

基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的一步酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B_1

从噬菌体展示的抗黄曲霉毒素B1(AFB_1)纳米抗体文库中,通过四轮亲和淘选,得到抗AFB_1纳米抗体G8。将编码纳米抗体G8的基因与碱性磷酸酶(AP)基因融合,构建了重组融合表达载体pET25b(+)-G8-AP,将其转化大肠杆菌BL21(Rosetta,DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合基因表达。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白G8-AP为可溶性表达,Ni^(2+)-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,对硝基苯磷酸二钠(pNPP)法测得纯化后的G8-AP的碱性磷酸酶比活力为(364.5±8.3)U/mg。ELISA检测结果表明,G8-AP具有特异识别AFB1的活性,与其它真菌毒素(AFB_2、AFG_1、AFG_2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B_1)无交叉反应。基于G8-AP建立了检测AFB1的一步ELISA法。在优化的条件下,即甲醇浓度20%、盐离子浓度20 mmol/L、pH 7.4条件下,方法的半数抑制浓度(IC_(50))为19.8 ng/mL,线性范围为4.3~92 ng/mL,检出限为2.6 ng/mL。对玉米和小麦样品加标回收实验结果表明,基质对本方法的干扰不明显,可用于实际样品检测。

臭氧降解稻谷中不同黄曲霉毒素B_1初始含量效果研究

针对黄曲霉毒素B_1(AFTB_1)污染造成的食用安全性问题,研究了稻谷储藏过程中AFTB_1含量随时间和黄曲霉量的变化规律以及臭氧降解率与稻谷中AFTB_1初始含量的关系。结果表明:30℃时,16.0%水分的稻谷AFTB_1含量(X)与储藏时间(T)呈极显著的抛物线型关系,回归方程为X=3.958T2-30.523T+45.049(R2=0.945,p<0.01),与黄曲霉量(M)呈正线性关系,回归方程为X=3.031E-005M+12.311(R^2=0.955,p<0.01)。随着稻谷中AFTB_1的初始含量增加,臭氧处理后的毒素降解率呈先上升后下降,降解率最大达到88.1%,在给定条件下,可将含68.42μg/kg AFTB_1的稻谷降解到国家限量标准(10μg/kg)。

伏马毒素B_1新型荧光标记物制备及其在荧光偏振分析技术中的应用

目的针对玉米中常见真菌毒素——伏马毒素B_1(FB1)开发新型荧光标记物,从而替代昂贵的6-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素(6-DTAF)标记物,并在此基础上开发基于荧光偏振原理的伏马毒素快速检测技术。方法采用一锅煮的合成方法,以5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素(5-DTAF)为荧光基团制备伏马毒素荧光标记物,然后利用荧光偏振的原理建立基于5-DTAF的伏马毒素快速检测技术。结果基于5-DTAF的FB1荧光标记物与基于6-DTAF的FB1荧光标记物的荧光偏振分析方法具有相同的分析性能,IC_(50)值基本相等。结论采用5-DTAF成功制备了FB1荧光标记物,同时利用该荧光标记物开发了伏马毒素荧光偏振快速检测技术。该分析技术与基于6-DTAF荧光标记物的FB1荧光偏振速测技术相比,具有同样的分析性能,但分析成本降低了一半。

伏马菌素B_1单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

制备了高亲和力的伏马菌素B_1(FB_1)单克隆抗体,进而建立了谷物中FB_1的直接竞争化学发光酶联免疫检测方法(dc-CLEIA)。采用碳化二亚胺法成功合成了FB_1人工抗原,经杂交瘤技术获得分泌FB_1特异性抗体的细胞株,高碘酸钠法酶标单克隆抗体后,建立了FB_1的dc-CLEIA,本方法的IC_(50)值为1.43μg/L,线性范围为0.32～8.40μg/L,检出限为0.13μg/L,竞争反应时间仅需20 min。玉米样品加标回收率为100.2%～115.4%,相对标准偏差小于8.7%,谷物样品的检测结果与高效液相色谱法及商业化ELISA试剂盒检测结果相符。

黄曲霉毒素B_1污染玉米的比重筛分研究

研究比重法对AFB_1污染玉米的筛分效果。结果表明:风量、纵向倾角和振幅对比重筛分效果具有显著影响(P<0.05),且在风量为6 000m^3/h、倾角7°、振幅15mm时,不同污染程度的玉米经比重筛分后,相比原料中的AFB_1含量,重质玉米中AFB_1含量分别降低21.2%和38.4%,轻质玉米和破碎率比例适中。比重筛分机是中国粮食生产中的重要设备,通过比重筛分去除AFB_1污染严重玉米具有良好的应用前景。