GM-SCF与LMP2A融合基因GC2A重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒基因LMP2A融合基因GC2A的重组腺病毒表达载体。方法:将构建的融合基因GC2A定向亚克隆至质粒pAdTrack-CMV上,经酶切及电泳检测后,PmeL酶切pAdTrack-CMV-GC2A,与质粒pAdEasy-1一起电转化E.coli.BJ5183,筛选重组菌,经PacⅠ酶切鉴定后用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组腺病毒vAd-GC2A,采用pAdTrack-CMV-GC2A中报告基因GFP的表达,观测其表达情况。结果:采用内切酶Bg1Ⅱ和EcoRⅤ对质粒pAdTrack-CMV-GC2A进行双酶切分析,电泳后可观察到约1 961和9 200bp的片段。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切后观察到约33kb的DNA片段和4.5kb的DNA片段,说明pAdTrack-CMV-GC2A和pAdEasy-1的重组发生在ori和右臂区,pAd-GC2A经PacⅠ酶切线性化后,磷酸钙法转染293细胞,56h后在荧光倒置显微镜下可看到有绿色荧光出现,说明已转染成功,并能在293细胞中表达。结论:融合基因GC2A正确插入,真核表达载体vAd-GC2A成功构建,在293细胞中包装获得重组腺病毒。