基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白,其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治,产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点,特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰,为其功能修饰和创新应用创造了条件,相关研究蓬勃发展,成效显著。大量研究表明,采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略,是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段;此外,采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略,也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制,梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展,并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果,探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径,为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

重组结核杆菌融合蛋白在肺结核密切接触者中筛查结核分枝杆菌感染效果分析

目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)现状。方法:2023年10月23日至11月14日在上海市奉贤区和金山区共选取140名肺结核密切接触者作为研究对象,对每名研究对象同时采用γ-干扰素释放试验(IGRA)和EC皮肤试验进行结核感染检测,采用Kappa值检验两种方法结果一致性,采用χ^(2)检验比较两组检测方法之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:140名研究对象,包括男性55例,女性85例;IGRA阳性率为15.00%(21/140),EC皮肤试验阳性率为14.29%(20/140),两种试验方法一致性检验Kappa值为0.857,差异无统计学意义(χ^(2)=0.029,P=0.866),两种检测方法检测结果为高度一致性;以IGRA作为结核感染的参考标准,EC皮肤试验的敏感度为85.71%(18/21)、特异度为98.32%(117/119)、阳性预测值为90.00%(18/20)、阴性预测值为97.50%(117/120);男性EC阳性率(32.73%,18/55)明显高于女性(2.35%,2/85),差异有统计学意义(χ^(2)=17.983,P<0.001)。结论:EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于肺结核密切接触者结核分枝杆菌感染筛查,但受限于使用年龄和接种禁忌证,可采用IGRA对无法进行EC皮肤试验者进行补充检测。

关节腔内注射肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对难治性类风湿关节炎患者关节积液情况、膝关节功能及ACPA水平的影响

目的 探讨关节腔内注射肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白[rhTNFR:Fc,益赛普(etanercept)]对难治性类风湿关节炎(RA)患者关节积液情况、膝关节功能及抗瓜氨酸肽抗体(ACPA)水平的影响。方法 选取我院收治的难治性RA患者为研究对象,分为两组。对照组患者给予甲氨蝶呤片等常规基础治疗,研究组在对照组基础上于患者关节腔内注射rhTNFR:Fc治疗,观察治疗后两组患者关节积液情况、膝关节功能及ACPA水平的变化。结果 研究组治疗有效率高于对照组(P<0.05)。治疗后,研究组患者关节积液深度、滑膜厚度低于对照组(P<0.05);VAS评分低于对照组(P<0.05);Lysholm膝关节功能评分高于对照组(P<0.05);血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、ACPA水平低于对照组(P<0.05);两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 于难治性RA患者关节腔内注射rhTNFR:Fc疗效明显,能够减少关节积液量,改善膝关节功能,延缓病情发展。

胃癌组织中突触融合蛋白6的表达与临床病理特征及远期预后的相关性

目的分析胃癌组织突触融合蛋白6(STX6)表达与临床病理特征及远期预后的相关性。方法收集2019年6月至2022年6月在河南中医药大学第五临床医学院(郑州人民医院)的82例胃癌患者,采用免疫组织化学法检测STX6表达情况,采用χ2检验分析STX6与临床病理特征的相关性;随访至2023年6月,记录所有胃癌患者的生存结局,采用Pearson相关性分析胃癌组织中STX6表达与远期预后的相关性。结果胃癌组织STX6表达阳性率为65.85%,高于癌旁组织50.00%(P<0.05)。胃癌组织中STX6表达与肿瘤部位、肿瘤直径及分化程度无相关性(P>0.05),但与TNM分期、淋巴结转移及人类表皮生长因子受体-2(HER-2)有关(P<0.05)。经log-rank检验显示,STX6阳性表达者的总生存时间较STX6阴性表达者短(P<0.05)。经Pearson相关性分析显示,胃癌组织中STX6表达与患者总生存期呈负相关(r<0,P<0.05)。结论胃癌组织中STX6呈高表达,且胃癌患者临床病理特征和远期预后与STX6表达有关。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗中毒性表皮坏死松解症的疗效及安全性

目的探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗中毒性表皮坏死松解症(TEN)患者的临床疗效及安全性。方法回顾性选取2020年1月至2022年1月海南医学院第一附属医院TEN患者20例,均给予rhTNFR:Fc治疗。治疗21 d后,记录TEN患者临床疗效,比较治疗前与治疗后不同时段(治疗后7、14、21 d)的药疹面积和严重程度指数(DASI)评分[DASI评分平均值,50%DASI(DASI50)、75%DASI(DASI75)、90%DASI(DASI90)所占比例]、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、体温下降时间、皮疹控制时间、住院时间及药物治疗的安全性。结果治疗21 d后,TEN患者中,显效18例(90.00%),有效2例(10.00%)。TEN患者治疗后7、14、21 d的DASI评分分别为(30.44±5.68)、(5.28±2.31)、(2.04±1.12)分,均明显低于治疗前[(52.34±7.45)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。相较治疗前、治疗7 d、治疗14 d,治疗21 d后的DASI50(100.00%)、DASI75(100.00%)、DASI90(90.00%)的改善比率最高,差异均有统计学意义(P<0.05)。TEN患者治疗后7、14、21 d的血清TNF-α水平分别为(22.73±5.58)、(15.99±4.60)、(4.44±1.10)pg/mL,均低于治疗前[(33.63±17.36)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。TEN患者体温下降时间为(2.49±0.81)d,皮疹控制时间为(5.19±1.90)d,住院时间为(11.92±4.20)d。治疗期间患者未出现终止治疗或失访,均未出现急性不良反应,随访期间病情未见复发,定期复查结果显示并无合并症、活动性肝炎与结核疾病等。结论rhTNFR:Fc作为治疗TEN疾病的药物其疗效随治疗时间延长而提高,可降低血清TNF-α水平与DASI评分,且安全性较高。

代谢工程改造热带假丝酵母生产鼠尾草酸

鼠尾草酸(carnosic acid,CA)是一种酚类二萜化合物,广泛存在于鼠尾草等唇科类植物中。CA具有抗肿瘤等多种生理以及药理活性,在日化、食品、医疗领域应用价值巨大。热带假丝酵母具有鲁棒性强、耐高温、产油脂等特性,因而在萜类化合物高效生产方面极具潜力。该研究根据热带假丝酵母密码子偏好性对来源于鼠尾草的铁锈醇合酶基因CYP76AH24和鼠尾草酸合酶基因CYP76AK6、来源于拟南芥的细胞色素还原酶基因ATR1进行全序列密码子优化以及基因合成。以生产鼠尾草酸前体次丹参酮二烯热带假丝酵母1C2PM04作为出发菌株,将上述基因整合到其基因组中成功合成鼠尾草酸。利用模块化工程与酵母不同亚细胞区室的空间组合,将上述3条基因以模块化的方式导入胞质和过氧化物酶体中进行表达,鼠尾草酸产量分别为10.25 mg/L和4.64 mg/L。通过下调角鲨烯合酶基因ERG9,降低法尼基焦磷酸池的消耗进而改变代谢通量进一步提高鼠尾草酸产量,效价达到26.3 mg/L。将细胞色素P450酶和细胞色素还原酶进行融合表达,测试以刚性linker(E3AK,E3AK×2,E3AK×3)和柔性linker(G4S,G4S×2,G4S×3)为连接肽,融合表达CYP76AH24和ATR1,鼠尾草酸产量提高1.54倍。该文通过增加CPR拷贝数,增加电子供体,进一步提高鼠尾草酸表达水平,产量达到78.24 mg/L。

猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

碳水化合物结合域对木聚糖酶酶学性质的影响

【目的】旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响。【方法】通过底物吸附方法,利用考马斯亮蓝G250法检测溶液中CBM在吸附前后的浓度,计算CBM的底物结合率,筛选到了结合木聚糖能力较好的CBM1和CBM4。为了探究对底物结合能力高的CBM融合位置对木聚糖酶酶学性质的影响,将CBM1和CBM4通过柔性连接肽分别与XYN的C端和N端融合,并在大肠杆菌中表达获得4种重组酶,分别命名为CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4。【结果】CBM1和CBM4与木聚糖结合率分别为89%和95%。在60℃,pH 7.0反应条件下,XYN、CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4的比活力分别是32 274.81、49 342.21、602.48、230.42和2 362.24 U/mg,CBM1-XYN比活力较XYN比活力提高了1.5倍。酶学性质分析表明,CBM1使XYN温度稳定性和pH稳定性得到了提高,将XYN和CBM1-XYN分别在60℃孵育1 h,CBM1-XYN残余酶活力和XYN残余酶活力分别为81%和28%;在pH 3-11范围内,CBM1-XYN在4℃孵育12 h后能够保持90%以上的酶活力。【结论】在大肠杆菌中成功异源表达了链霉菌来源的木聚糖酶,筛选到了对底物结合率高的两种CBM1和CBM4,并通过蛋白质融合技术成功将CBM融合到XYN上,获得酶学性质得到改良的CBM1-XYN,能够提高木聚糖酶的温度稳定性、pH耐受性及比酶活。

牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的生物学功能

牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)是一种在世界范围内引起牛呼吸道疾病的病毒性病因之一,主要引起1岁龄以下犊牛的严重下呼吸道感染。BRSV共编码9种结构蛋白,其中附着蛋白(G蛋白)和融合蛋白(F蛋白)是BRSV表面主要的包膜糖蛋白,参与病毒吸附、融合宿主细胞的过程。G和F蛋白含多种识别表位,能够刺激机体产生中和抗体反应,常常是牛呼吸道合胞体病(bovine respiratory syncytial disease, BRSD)疫苗开发所关注的重点。探究G和F蛋白在BRSV侵染中的作用机理对于病毒致病机理分析、疫苗开发具有重要意义。本文旨在对牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的结构功能及有关疫苗的开发加以综述,以期为BRSV疫苗的研制和BRSD的防控提供参考。

TIM-1-Fc融合蛋白对哮喘小鼠Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡的调节

目的制备T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域1(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-1,TIM-1)-Fc融合蛋白并探讨TIM-1-Fc融合蛋白对卵白蛋白(ovabumin,OVA)诱导的哮喘小鼠的干预作用及潜在作用机制。方法通过基因工程技术获得TIM-1-Fc融合蛋白。采用腹腔注射OVA氢氧化铝溶液致敏建立过敏性哮喘小鼠模型,随机分为对照组、哮喘组和TIM-1-Fc干预组。每次干预前20 min,使用40μL卵白蛋白生理盐水溶液(OVA-NS)滴鼻,TIM-1-Fc融合蛋白干预包括TIM-1-Fc滴鼻组(每只小鼠每次给予1μg/40μL TIM-1-Fc滴鼻)和TIM-1-Fc注射组(每只小鼠每次给予6μg/200μL TIM-1-Fc腹腔注射),每天1次,连续7 d,对照组用生理盐水替代。采用苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化;采用流式细胞术检测小鼠外周血中辅助性T细胞2(type 2 T helper cells,Th2)、辅助性T细胞17(type 17 T helper cells,Th17)和调节性T细胞(Treg)比例及相关细胞因子水平。结果成功构建TIM-1-Fc融合蛋白,成功构建OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型。与哮喘组相比,TIM-1-Fc融合蛋白干预后显著减轻了哮喘小鼠气道炎性损伤和肺组织损伤;TIM-1-Fc融合蛋白干预能显著降低外周血中TIM-1^(+)CD4^(+)T细胞和TIM-1^(+)Th17细胞比例,使TIM-1^(+)Treg细胞增多,显著降低Th2、Th17细胞比例,提高Treg细胞比例,调节哮喘中Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡。结论TIM-1-Fc融合蛋白改善OVA诱导的过敏性哮喘小鼠气道炎症和肺组织损伤,其作用机制可能与TIM-1-Fc融合蛋白对Th1/Th2和Th17/Treg的免疫调节有关。

细胞色素P450-RhFRED人工融合酶的研究进展与应用

来自于红球菌Rhodococcus sp.NCIMB 9784的P450RhF是一个自给自足型的细胞色素P450酶,它的血红素结构域主要负责控制酶的底物特异性,P450还原酶伴侣蛋白RhFRED与细胞色素P450血红素结构域天然融合在一起,电子主要从蛋白分子内转移到P450血红素结构域。依据融合型P450RhF自给自足的特性,有学者利用P450RhF的还原伴侣蛋白RhFRED,与其它P450构建人工融合酶P450-RhFRED,来实现多种细胞色素P450基因的功能表达。基于此建立的P450-Rh-FRED融合文库对未知功能P450的催化功能探索有很大意义,P450-RhFRED融合酶技术也可用于开发已知细胞色素P450酶的工业应用。

重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

结核分枝杆菌Rv3425-16kD融合蛋白原核表达及其刺激ATB患者IFN-γ释放水平研究

目的 原核系统表达与纯化结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)融合蛋白抗原Rv3425-16kD,检测其能否被活动性结核病(active tuberculosis, ATB)中肺结核患者和结核潜伏性感染(latent TB infection, LTBI)者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)识别,探讨作为诊断抗原鉴别活动性结核感染的可行性。方法 利用原核表达系统表达融合蛋白Rv3425-16kD并进行亲和纯化,以Western Blot法鉴定;收集结核病医学部收治的的ATB患者、LTBI者和健康人外周血,分离PBMCs,分别用Rv3425-16kD融合蛋白、早期分泌靶抗原6/培养液蛋白10(ESAT-6/CFP10)和MTB全菌裂解液刺激后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR方法检测γ-干扰素(Interferon-γ,INF-γ) mRNA的表达,通过t检验分析刺激前后PBMCs IFN-γ mRNA的表达差异。结果 原核系统表达及纯化的Rv3425-16kD融合蛋白相对分子质量均为37kD。健康人PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为4.2±1.6,MTB全菌裂解液刺激后为14.7±3.5,差异具有统计学意义(P<0.001),另外两组刺激没有明显变化;ATB患者PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为3.7±1.2,经Rv3425-16kD融合蛋白、ESAT-6/CFP10抗原多肽和H37Rv全菌裂解液分别刺激后IFN-γ mRNA表达量为:166.0±29.7、13.7±5.8和213.0±33.5,三组抗原在刺激前后IFN-γ mRNA表达量差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论 原核重组的Rv3425-16kD融合蛋白可被ATB患者PBMCs细胞识别,具有较强抗原刺激作用和特异性,可用作MTB感染的预防及诊断。

子宫内膜样腺癌组织NuSAP1、MFN2表达与临床病理特征和预后的关系

目的探讨子宫内膜样腺癌(EA)组织核仁纺锤体相关蛋白1(NuSAP1)、线粒体融合蛋白2(MFN2)表达与临床病理特征和预后的关系。方法选取2019年3月至2020年10月南阳市第一人民医院收治的121例EA患者作为研究对象,应用免疫组织化学染色法检测患者癌组织及其对应癌旁组织NuSAP1、MFN2阳性表达率,分析癌组织NuSAP1、MFN2阳性表达率与患者临床病理特征的关系。出院后随访3年,完成随访112例,应用Kaplan-Meier生存曲线分析NuSAP1、MFN2阳性表达组和阴性表达组的预后差异,应用多因素COX回归分析EA患者预后的影响因素。结果EA癌组织NuSAP1阳性表达率为72.37%,明显高于癌旁组织的35.54%,MFN2阳性表达率为38.02%,明显低于癌旁组织的80.17%,差异均有统计学意义(P<0.05);国际妇产科联盟(FIGO)临床分期Ⅱ~Ⅲ期、中低分化、有淋巴结转移、深肌层浸润癌组织中NuSAP1阳性表达率分别为88.68%、83.54%、96.15%、90.63%,明显高于FIGO临床分期Ⅰ期的60.29%、高分化的57.14%、无淋巴结转移的55.79%、浅肌层浸润癌组织的66.29%,差异均有统计学意义(P<0.05);FIGO临床分期Ⅱ~Ⅲ期、中低分化、有淋巴结转移、深肌层浸润癌组织中MFN2阳性表达率分别为18.87%、30.38%、7.69%、15.63%,明显低于FIGO临床分期Ⅰ期的52.94%、高分化的52.38%、无淋巴结转移的46.32%、浅肌层浸润癌组织的46.07%,差异均有统计学意义(P<0.05);Kaplan-Meier法分析结果显示,NuSAP1阴性表达组和MFN2阳性表达组患者的3年生存率分别为90.00%和87.80%,明显高于NuSAP1阳性表达组的69.51%和MFN2阴性表达组的67.61%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论EA患者组织中NuSAP1阳性表达率升高,MFN2阳性表达率降低,NuSAP1、MFN2表达水平与患者肿瘤分化、FIGO临床分期、淋巴结转移及深肌层浸润有关,且是患者死亡的危险因素,提示NuSAP1、MFN2可能参与了EA患者的疾病进展。

氟中毒对神经细胞损伤及自噬的影响

目的探讨氟中毒对小鼠小胶质细胞株BV2和小鼠来源神经母细胞瘤细胞株N2a及小鼠大脑皮质神经细胞损伤及自噬的影响。方法8周龄清洁级雄性C57BL/6J野生型小鼠,随机分为对照组(饮水含氟量<0.5 mg/L)、低氟组(饮水含氟量10.0 mg/L)和高氟组(饮水含氟量50.0 mg/L),每组10只喂养12周;BV2及N2a正常培养后分对照组、低氟组(培养基含氟量1.0 mmol/L)和高氟组(培养基含氟量1.5 mmol/L);采用CCK8检测不同浓度氟处理下BV2和N2a细胞增殖活力变化,氟离子选择电极法检测造模小鼠尿、血、骨氟含量变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测BV2、小鼠大脑皮质中小胶质细胞活化标志物离子钙结合衔接分子1(Iba-1)的表达变化及N2a细胞、BV2细胞和小鼠大脑皮质中自噬相关微管相关蛋白1轻链3(LC3)及自噬受体蛋白P62蛋白(SQSTM1/P62)的表达水平;线粒体动力学及自噬融合分裂相关蛋白线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、动力相关蛋白1(Drp1)、张力蛋白同源物诱导的假定激酶1(Pink1)及E3泛素连接酶(Parkin)的表达水平。结果CCK8结果显示,1.5 mmol/LNaF处理的BV2、N2a细胞增殖活力明显下降(P<0.001,);低氟组小鼠氟斑牙发生率为60%,高氟组小鼠氟斑牙发生率为80%;与对照组比较,染氟组小鼠尿、血、骨氟含量明显上升(P<0.001);蛋白免疫印迹结果显示,与对照组比较,高氟组的小鼠大脑皮质和BV2的小胶质细胞活化标志物Iba-1表达水平显著升高(P<0.001,P<0.01),高氟组的小鼠大脑皮质和BV2及N2a细胞自噬相关蛋白LC3、Parkin、Pink1表达量显著增加(P<0.05)、P62水平显著下降(P<0.01);线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2水平显著增加(P<0.001),分裂蛋白Drp1无明显变化。结论氟中毒可导致线粒体损伤、破坏线粒体融合分裂平衡并引起细胞自噬,为阐明氟中毒神经系统损伤与细胞自噬之间相互关系提供新思路。

Mfn2调控VEGFR2/PI3K促进卵巢癌种植转移的机制研究

目的 探讨线粒体融合蛋白2(Mfn2)对卵巢癌种植转移的作用以及其可能的分子机制。方法 选取2019年6月至2021年6月于南京医科大学附属苏州医院就诊治疗的86例卵巢癌患者作为研究对象,对比癌组织和癌旁组织Mfn2、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)蛋白表达,分析Mfn2、VEGFR2、PI3K蛋白表达与相关病理特征的关系。构建Mfn2上调/下调卵巢癌SKOV-3细胞株并验证Mfn2、VEGFR2、PI3K的表达。结果 Mfn2、VEGFR2、PI3K在肿瘤组织中的阳性表达率高于癌旁组织,差异均有统计学意义(χ^(2)=4.597、6.456、3.930,P=0.032、0.011、0.047);不同FIGO分期、淋巴结转移、远处转移情况及生存情况中,卵巢组织中Mfn2、VEGFR2、PI3K蛋白表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC组对比,Mfn2上调组卵巢癌SKOV-3细胞中Mfn2 mRNA相对表达量和Mfn2、VEGFR2、PI3K蛋白、显著上调(P<0.05);与shNC组对比,shMfn2下调组卵巢癌SKOV-3细胞中Mfn2mRNA相对表达量和Mfn2、VEGFR2、PI3K蛋白显著下调(P<0.05)。结论 下调Mfn2表达与VEGFR2、PI3K表达水平可以预防卵巢癌种植转移。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎的临床效果

目的 观察重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎的临床效果及对血清相关指标的影响。方法 选取2020年3月—2022年7月龙岩市第二医院血液风湿科收治的类风湿关节炎患者98例,依据随机抽签法分为联合抗风湿组和常规抗风湿组,每组49例。常规抗风湿组采取常规抗风湿治疗,联合抗风湿组在常规抗风湿组基础上使用注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白治疗,2组均持续治疗6个月。比较2组患者临床疗效,治疗前后症状改善情况、血清类风湿炎性指标[C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、类风湿因子(RF)、白介素-6(IL-6)],不良反应。结果 联合抗风湿组治疗总有效率为95.92%,高于常规抗风湿组81.63%(χ^(2)=5.018,P=0.025)。治疗6个月后,2组晨僵时间较治疗前缩短,压痛指数评分、疼痛指数评分较治疗前降低,且联合抗风湿组短/低于常规抗风湿组(P均<0.01);2组CRP、RF、IL-6水平较治疗前下降,ESR较治疗前缩小,且联合抗风湿组低/小于常规抗风湿组(P均<0.01)。联合抗风湿组不良反应总发生率为4.08%,低于常规抗风湿组的18.37%(χ^(2)=5.018,P=0.025)。结论 常规抗风湿治疗基础上采用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎的疗效显著,利于临床症状、血清指标的改善,降低炎性因子水平及减少不良反应发生,促进病症好转。

TNF-α抑制剂注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白/注射用依那西普致葡萄膜炎2例分析

目的探讨TNF-α抑制剂与葡萄膜炎发病的关系并分析TNF-α抑制剂诱发性葡萄膜炎的临床特点。方法回顾性分析2021年7月至2023年2月某院收治的2例使用TNF-α抑制剂注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白注射用依那西普后出现葡萄膜炎患者的临床特征并复习相关文献。结果2例患者葡萄膜炎发生时间分别在用药后2周和6周,其中前葡萄膜炎1例,前、中间葡萄膜炎1例,经对症治疗后均有好转。在持续生物制剂治疗过程中2例患者均有反复发作倾向。查阅文献发现目前引起葡萄膜炎的TNF-α抑制剂主要包括英夫利昔单抗、阿达木单抗等,多用于治疗类风湿性关节炎、肿瘤、强直性脊柱炎、眼内葡萄膜炎患者等。患者年龄区间在5~77岁,发病时间为用药后1周~4年。经系统治疗,停止免疫抑制剂后,绝大多数诱发性葡萄膜炎患者视力可恢复。结论TNF-α抑制剂可以诱发葡萄膜炎的发生,发病类型以前葡萄膜炎为主,且有复发倾向。及时诊疗后患者的视力预后较好。

何氏育麟方通过调控线粒体分裂-融合改善早发性卵巢功能不全模型小鼠卵巢功能实验研究

目的探究何氏育麟方改善早发性卵巢功能不全(POI)模型小鼠卵巢功能的作用机制。方法SPF级雌性育龄期小鼠50只,按随机数字表法分为正常组、模型空白组、阳性对照组及中药低、高剂量组,各10只。环磷酰胺连续腹腔注射2周建立POI小鼠模型。正常组及模型空白组给予蒸馏水灌胃,阳性对照组给予辅酶Q10溶液灌胃,中药低、高剂量组分别给予33、66 g/kg何氏育麟方灌胃。给药6周后,测定小鼠血清抗苗勒管激素(AMH)水平。取小鼠卵巢组织,电镜下观察卵母细胞中线粒体的形态;MitoSOX测定卵母细胞氧化应激活性氧水平;JC-1染色共聚焦显微镜观察卵母细胞中线粒体的膜电位。通过蛋白质印迹法检测线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、线粒体动力蛋白相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)在小鼠卵巢组织中的表达水平。结果与正常组比较,模型空白组AMH[(2204.34±250.49)pg/mL比(3024.48±325.18)pg/mL,P<0.01]、膜电位[(0.493±0.025)△Ψm比(2.737±0.338)△Ψm,P<0.01]、Mfn1蛋白表达水平[(0.307±0.076)比(1.000±0.194),P<0.01]、Mfn2蛋白表达水平[(0.179±0.056)比(1.000±0.149),P<0.01]水平降低,2',7'-二氯荧光素(DCF)荧光强度[(63.250±5.855)比(16.206±1.863),P<0.01]、Drp1蛋白表达水平[(9.266±0.096)比(1.000±0.278),P<0.01]、Fis1蛋白表达水平[(2.437±0.153)比(1.000±0.167),P<0.01]升高。与模型空白组比较,阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组AMH[(2712.50±226.33)pg/mL、(2657.63±354.82)pg/mL、(2823.73±316.04)比(2204.34±250.49)pg/mL,P<0.05或P<0.01]、膜电位[(1.534±0.114)△Ψm、(1.058±0.059)△Ψm、(1.770±0.115)△Ψm比(0.493±0.025)△Ψm,P<0.05或P<0.01]、Mfn1蛋白表达水平[(0.870±0.163)、(0.738±0.109)、(0.902±0.122)比(0.307±0.076),P<0.05或P<0.01]、Mfn2蛋白表达水平[(0.769±0.116)、(0.557±0.079)、(0.802±0.094)比(0.179±0.056),P<0.01]升高,DCF荧光强度[(32.851±2.871)、(53.561±2.538)、(26.371±1.742)比(63.250±5.855),P<0.05或P<0.01]、Drp1蛋白表达水平[(4.455±1.205)、(6.966±1.016)、(2.192±1.028)比(9.266±0.096),P<0.05或P<0.01]、Fis1蛋白表达水平[(1.737±0.163)、(1.974±0.173)、(1.357±0.111)比(2.437±0.153),P<0.05或P<0.01]降低。电镜下观察卵巢线粒体形态,阳性对照组和中药低、高剂量组线粒体形态、数量及分布情况均不同程度改善。结论何氏育麟方通过影响POI模型小鼠卵母细胞线粒体分裂-融合蛋白表达,改变线粒体结构和功能,降低卵巢活性氧水平,进而改善卵巢功能。

马铃薯三糖甘草次酸衍生物通过抑制SARS-CoV-2进入靶细胞作为潜在的小分子新冠病毒融合抑制剂

目的 研究马铃薯三糖甘草次酸衍生物能否通过抑制SARS-CoV-2进入靶细胞,作为潜在的小分子新冠病毒融合抑制剂。方法 以天然SARS-CoV-2进入抑制剂甘草酸为先导化合物,利用活性亚结构的拼合原理等设计并合成了系列马铃薯三糖甘草次酸衍生物。利用SARS-CoV-2假病毒体外细胞感染模型,检测该系列甘草次酸衍生物的体外抗SARS-CoV-2活性;利用表面等离子共振技术及假病毒模型寻找先导化合物1b的抗病毒作用靶点;利用SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合体系,检测先导化合物1b是否作用于SARS-CoV-2病毒入侵宿主的膜融合过程;基于分子对接与定点突变技术,确定先导化合物1b与S蛋白的作用模式等。结果 先导化合物1b对SARS-CoV-2奥密克戎假病毒有显著抑制作用,EC50值为3.28μmol/L(P<0.05),对其它SARS-CoV-2变异株假病毒有广谱抗病毒活性。细胞-细胞膜融合实验显示1b能够抑制合胞体的形成。分子对接预测先导化合物1b可与S1与S2亚基交界处的空腔中的Glu309、Ser305、Arg765、Lys964等多个保守氨基酸残基产生氢键作用,亲和力为-8.6 kcal/mol。化合物1b在10、5、2.5、1.25μmol/L时对Arg765、Lys964、Glu309和Leu303突变后的假病毒的抑制活性显著降低(P<0.01)。结论 马铃薯三糖甘草次酸衍生物能够靶向作用于S蛋白,特异性干扰病毒-细胞膜融合阶段,继而发挥抗SARS-CoV-2感染的作用,是一类结构新颖的小分子SARS-CoV-2融合抑制剂。