3株HPI^+大肠杆菌fyuA与int基因的检测及序列分析

在耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的基因中,fyuA编码鼠疫菌素受体与细菌的摄铁能力调节有关,int编码的整合酶与HPI在大肠杆菌基因组asn-tRNA位点的整合相关。根据GenBank中已发表的HPI基因序列设计2对引物,分别用于fyuA和int的PCR扩增。将从3株仔猪腹泻源HPI+大肠杆菌(S70903株、S70925株、S70931株)中扩增的片段克隆至pGEM-Teasy载体,分别获得含有fyuA和int的重组质粒。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明:所克隆的fyuA基因大小均为948 bp,与已发表序列的同源性为98.6%~100%。所克隆的int基因片段大小均为1 391 bp,与已发表序列的同源性为96.0%~99.6%。研究结果提示,这3株细菌的fyuA基因并没有因为HPI的转移而缺失或被修饰,并且均整合在大肠杆菌基因组asn-tRNA位点。

尿路致病性大肠埃希菌FYUA基因敲除株的构建及其生物学特性

目的构建尿路致病性大肠埃希菌FYUA基因敲除株,比较野生株和敲除株之间生物学特性的改变。方法利用λRed同源重组系统构建FYUA基因敲除株△FYUA;测定A600绘制CFT073和△FYUA在LB液体培养基和无菌尿液中的增殖曲线;平板菌落计数法比较CFT073和△FYUA菌落形成能力;利用96孔板结晶紫染色法比较CFT073和△FYUA生物膜形成能力。结果成功构建CFT073 FYUA基因敲除株△FYUA;CFT073和△FYUA在LB液体培养基中具有相似的增殖曲线,△FYUA在无菌尿液中的增殖速率明显低于CFT073(P<0.05);CFT073和△FYUA菌落形成能力无明显区别;△FYUA的生物膜形成能力低于CFT073(P<0.05)。结论 FYUA基因对于菌株在无菌尿液中的生长繁殖以及生物膜形成可能发挥重要作用。

大肠埃希菌强毒力岛核心基因fyuA研究进展

强毒力岛(HPI)基因最先在耶尔森菌体内检出,是一种负责编码合成、调节和运输铁转运系统相关受体蛋白的基因,可显著提高细菌的毒力。HPI通过水平转移进入大肠埃希菌中,提高大肠埃希菌致病性及生存增殖能力,对食品安全、人类健康造成危害。fyuA基因位于HPI的核心功能区irp2-fyuA基因簇,常作为HPI毒力岛基因检测的标志性基因之一。关于fyuA基因及其表达产物的研究将为大肠埃希菌感染性疾病的治疗与预防提供新思路。

肺炎克雷伯菌铁摄取调节蛋白(Fur)的生物学功能及对fyuA的转录调控

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)是细菌重要的调控因子,研究旨在探究肺炎克雷伯菌Fur对铁摄入及生物膜形成的影响,分析Fur对可能的靶基因fyuA(耶尔森菌素的受体)的调控作用.首先,采用同源重组技术构建突变株Δfur及回补株C-Δfur.然后,采用生长曲线、CAS检测和结晶紫染色对野生株、突变株及回补株的铁摄入及生物膜形成表型进行测定.最后,通过RT-qPCR及GFP报告基因融合实验明确Fur对fyuA的调控.结果显示,成功构建突变株及回补株;生长曲线分析表明fur基因影响细菌生长速度;fur的缺失使铁载体的生成量增加,生物膜的形成减少;铁充足条件下,Fur负调控fyuA基因的表达.研究通过构建fur基因敲除株,初步分析了肺炎克雷伯菌铁摄取调节蛋白Fur的功能,明确了Fur对fyuA的转录调控机制.

APEC强毒力岛核心基因irp2、fyuA敲除对其致病性影响的研究

采用Red同源重组技术分别构建出APEC irp2单基因敲除株△AE17和irp2、fyuA双基因敲除株△△AE17。运用活菌计数法分别观察AE17、△AE17、△△AE17黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力。并且应用Real-time PCR检测AE17、△AE17和△△AE17中的luxs,pfs,tsh,ibeA,stx2f,iss,ompA,fimC 8个毒力基因转录水平。结果成功构建出基因敲除株△AE17和△△AE17,它们黏附DF-1细胞的能力分别下降为AE17的66.04%和53.54%。同时,Real-time PCR结果显示,△AE17的luxs,iss,ompA和fimC等4个毒力基因的转录水平均极显著下降(P<0.01),△△AE17的luxs,pfs,tsh,iss,ompA和fimC等6个毒力基因的转录水平极显著的下降(P<0.01)。结果表明强毒力岛中核心基因的敲除能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使其毒力基因的转录水平有所降低。irp2、fyuA双基因敲除较irp2单基因敲除对APEC的致病性影响更显著。

腹泻仔貉检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌

目的为了解大肠杆菌引起仔貉腹泻的机理,进行了小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的检测,并对其菌株作毒力试验。方法用PCR扩增法检测毒力岛基因irp2和fyua,小鼠腹腔注射检测菌株毒力。结果从3个貉场腹泻病死貉脏器以及粪便中分离出血清型分别为O23和O20的大肠杆菌,对两血清型大肠杆菌进行毒力岛检测,均检出携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyuA。2个血清型O23、O20大肠杆菌均分别使小鼠发病死亡。结论仔貉腹泻是由携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyua的大肠杆菌引起,该菌对仔貉的健康具有潜在的威胁。

银川地区鸡源致病性大肠杆菌耶尔森菌强毒力岛相关基因的检测及序列分析

为了研究耶尔森菌强毒力岛(HPI)在银川地区鸡源致病性大肠杆菌中的分布情况,试验根据HPI相关基因irp2和fyuA的参考序列设计引物,采用双重PCR方法对分离的20株鸡源致病性大肠杆菌进行这两种基因的扩增和检测,以及基因克隆和核苷酸序列分析。结果表明:irp2和fyuA基因在鸡源致病性大肠杆菌分离株中的阳性率均为40%(8/20);这两种毒力岛相关基因的核苷酸序列与GenBank中报道的基因核苷酸同源性高达98%以上。说明irp2和fyuA基因具有较高的保守性。

腹泻水貂检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌

为了解大肠杆菌引起水貂腹泻的机理,进行了小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的检测,并对其菌株做毒力试验。用PCR扩增法检测毒力岛基因irp2和fyua,小鼠腹腔注射检测菌株毒力。结果:从3个貂场腹泻病死水貂脏器以及粪便中分离出血清型分别为O78、O29和O38的大肠杆菌,对3个血清型大肠杆菌进行毒力岛检测,均检出携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyua。3个血清型O78、O29和O38的大肠杆菌均使小鼠发病死亡。结果表明水貂腹泻是由携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyua的大肠杆菌引起,该菌对水貂的健康具有潜在的威胁。