人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达

目的构建高效表达球状脂联蛋白的真核表达载体,为研究脂联素、球状脂联蛋白在2型糖尿病及动脉粥样硬化中的作用奠定基础。方法克隆人脂联素基因,构建球状脂联蛋白基因的真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),Western blot检测上清中球状脂联蛋白的表达。结果测序结果表明克隆的人脂联素基因序列正确;构建的球状脂联蛋白基因真核表达载体能有效转染HUVEC,并在上清中检测到该基因的表达。结论完成人脂联素基因克隆,成功构建了人球状脂联蛋白基因真核表达载体,并在HUVEC中获得分泌表达,为研究球状脂联蛋白对2型糖尿病的干预作用提供了可能。

脂联素及其球状区在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:克隆表达有生物学活性的脂联素及其球状区蛋白,并制备抗体。方法:以pQE30-adiponectin质粒为模板,PCR扩增脂联素及其球状区蛋白基因片段,插入pGEX-4T-2载体,转化大肠杆菌BL21后获得表达,用GSTrap柱亲和纯化可溶性表达的蛋白。用纯化的蛋白免疫家兔制备多抗,Westernblot鉴定抗体与人血清中脂联素的反应性。结果:PCR扩增脂联素基因片段长约710bp,脂联素球状区基因片段长约430bp。表达的GST-脂联素融合蛋白表观Mr约51000,GST-脂联素球状区融合蛋白表观Mr约42000,纯化后纯度高于90%。免疫产生的抗体与人血清中的脂联素能特异性结合。结论:表达获得的脂联素蛋白和制备的抗体为脂联素的检测及对其功能的研究奠定了基础。