一种中药鉴定gDNA芯片的制备与展望

中药鉴定是中药质量控制系统的首要环节,中药鉴定技术的不断发展提高了药材品质评价水平。至今,中药鉴定技术经历着从传统生药鉴定学的细胞和亚细胞水平向遗传物质DNA分子水平发展的历程,运用DNA芯片技术进行中药鉴定成为中药鉴定发展的方向之一。介绍了筛选gDNA种特异性探针的抑制性差减微阵列“SSH-ar-ray”新技术,该技术是将抑制性差减杂交与基于尼龙膜微阵列杂交相结合。以名贵中药材石斛5个品种作为实验材料,首先是用抑制性差减杂交获得2个品种之间的gDNA差异片段,然后用这些gDNA差异片段与由所有研究品种的gDNA制备成的微阵列杂交筛选到某一个品种的种特异性gDNA片段。这些种特异性gDNA探针作为种特异性探针进行物种鉴定。在此基础上建立中药鉴定gDNA芯片的方法并对其应用进行了展望探讨。

棉花枯萎菌gDNA不同提纯方法的比较研究

以棉花枯萎菌菌株为试验材料 ,在CTAB法、SDS CTAB法等基础上加以改进 ,对 4种提纯棉花枯萎菌DNA的方法进行了比较研究。结果表明 :SDS CTAB法是适合于棉花枯萎菌DNA提取的方法。该方法提取的DNA纯度高 ,产率高 ,无明显降解现象 ,能很好地被限制性内切酶酶切 ,并用作PCR模板。

甜菜NADH-NR gDNA全长序列的克隆及酶切鉴定

为了研究甜菜NADH-NR gDNA的序列特征,从分子水平上为甜菜硝酸盐累积差异机理的研究做铺垫;利用二倍体甜菜品种‘甜研7号’,采用分步克隆方法,分别获得甜菜NADH-NR基因组DNA的3’端序列和5’端序列以及中间序列,再以3’端和5’端序列设计特异引物,克隆获得甜菜NADH-NR基因组DNA的全序列;结果表明,甜菜NADH-NR gDNA全长序列6346bp,经与先前获得的甜菜NADH-NR cDNA序列比对,甜菜NADH-NR gDNA含有3个内含子,4个外显子。内含子大小分别为197、1088、2343bp。甜菜NADH-NR gDNA的外显子序列与菠菜的同源性达到78%,但内含子序列在进化期间发生了较大分化,甜菜NADH-NR gDNA的内含子相对菠菜要大,两者也不处于同样的位点,甜菜NADH-NR gDNA的内含子靠近5'端较早出现,每个内含子大小均是菠菜的1.10～1.71倍。本研究首次从甜菜中克隆获得NADH-NR gDNA全长序列,揭示了其序列特征并将其与其他作物进行了比较分析,为进一步利用该基因开展甜菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。

蜘蛛HMW-gDNA的电洗脱纯化提取

该文研究了蜘蛛大分子量基因组DNA(HMW-gDNA)的提取以及一种高效电洗脱纯化装置的构建。以蜘蛛胸部肌肉组织为原料,通过自改良CTAB法提取蜘蛛HMW-gDNA,利用透析膜和2mL离心管构建一种新的HMW-gDNA快速凝胶回收装置,并对蜘蛛HMW-gDNA进行电洗脱分离回收。结果显示,改良CTAB法可高效提取蜘蛛HMW-gDNA(>48.5kb),且通过透析膜的截留作用,对普通琼脂糖凝胶中目的HMW-gDNA进行快速电洗脱分离,其回收率超过75%,OD260/OD280处于1.8～2.0之间,对HMW-gDNA完整性无影响。综合结果表明,改良CTAB法可用于蜘蛛HMW-gDNA的提取,此电洗脱纯化装置可从普通琼脂糖中高效回收HMW-gDNA,是一种低成本、简捷、高效且实用性强的凝胶回收方法。

HPLC-磷光检测法测定钆双胺及其有关物质的含量

目的:建立 HPLC-磷光检测法测定钆双胺的含量及有关物质钆二亚乙基三胺五乙酸单钠-酰甲胺(GdNaDTPA-MMA)和钆二亚乙基三胺五乙酸二钠(GdNa_2DTPA)的含量。方法:采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;0.005 mol·L^(-1)醋酸三乙胺溶液(取水约980 mL,置1000 mL量瓶中,加冰醋酸287μg和三乙胺700μg,必要时用1 mol·L^(-1)醋酸溶液或1 mol·L^(-1)氢氧化钠溶液调节 pH 至6.8,加水稀释至刻度,摇匀)为流动相,流速为1.2 mL·min^(-1),以荧光检测器检测(磷光检测模式),激发波长为275 nm,发射波长为314 nm,进样量:20μL(有关物质)、10μL(含量测定)。结果:在含量测定项下,钆双胺在0.12～1.10mg·mL^(-1)的范围内线性关系良好(r=0.99997),平均回收率为99.8%,RSD≤0.6%。钆双胺与有关物质的分离度良好,钆双胺、GdNaDTPA-MMA 和 GdNa_2DTPA 的最低检测量分别为0.20,0.52,0.21μg。结论:本法快速,简便,结果准确。

改良CTAB法快速提取棉花DNA

针对棉花（Ｇｏｓｓｐｉｕｍ）富含棉酚、多糖等其它次生干扰物质这一特点而设计的一种快速分离和纯化棉花总ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）的方法。该方法是对ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）法的改良，它在ＣＴＡＢ法的基础上，首先用ＤＩＥＣＡ（ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍｉｃａｃｉｄ）抑制酚氧化酶的活性，然后用活性炭和ＰＶＰ４０（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）排除棉酚等其它次生干扰物质。试验证明，该方法比较简便、快速、经济、有效，得到的ｇＤＮＡ完全可以满足ＰＣＲ等分子生物学分析。

基因编辑技术最新研究进展

基因编辑是一种对基因组及其转录产物进行定点修饰、定向敲除或插入目的基因的基因编辑技术。近年来,基因编辑技术发展日新月异,不仅极大的推动了基因功能研究进程,同时为人类遗传疾病的治疗带来了曙光。综述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、Ago/g DNA和SGN等技术的作用原理、优缺点、应用等,以期为相关领域的研究提供参考。

中国主产棉区黄萎病菌的RAPD分析

在提取我国１２个省主产棉区２６个菌系ｇＤＮＡ的基础上，采用ＯＰＹ和ＯＰＢ两组随机引物，对这些菌系的基因组进行了ＰＣＲ扩增和聚类分析，４０个引物中，１２个引物扩增出满意的适合于分析的多态性谱带。聚类分析将２６个菌系分为Ａ、Ｂ两个群，Ｖａ菌系（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍａｌｂｏａｔｒｕｍ）属于单独的Ａ群，Ｂ群则包括了所有的大丽轮枝菌系（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）。Ｂ群又分为Ｂａ（Ｃｓ、Ｙｃ）及Ｂｂ两个亚群。Ｂｂ亚群下面分３个组，Ｂｂ１（ＡＶ２、ＡＶ３及Ｌｙ）、Ｂｂ２（Ｓａ、Ｊｉ、Ｋｅ及Ｙｃ）和Ｂｂ３。Ｂｂ３是最大的一个组，包括供试的３个大丽轮枝菌落叶型的３个菌系（ＶＤ－８、Ｔ９、Ｖ４４）和其他大部分非落叶型的菌系。不同的单孢之间ＲＡＰＤ分析的结果（引物ＯＰＹ０６检测出单孢之间２．０６ｋｂ的差异条带）从分子水平证实了单孢间变异的发生。对河南安阳４个菌株单独聚类分析则表现出致病性测定与ＲＡＰＤ分析有一定的相关性。

CRISPR/Cas9系统研究进展及应用

CRISPR/Cas9是目前应用广泛的基因组编辑工具,该系统利用一段RNA引导Cas9核酸酶可对多种细胞及动植物基因组实现特定位点的切割和修饰,具有操作简单、作用高效等优点。Ago是另一类核酸内切酶,具有良好的应用潜力。从CRISPR/Cas9的发展现状、结构基础、作用机制、改进后的基因编辑机制及基因编辑技术的应用等方面进行了综述,讨论其存在的问题,并提出相应对策。

从石蜡包埋组织中获取高质量基因组DNA的方法改进

从石蜡包埋组织中制备基因组DNA(gDNA)难度大、获取样本量很少.传统方法为二甲苯脱蜡法.为了简化操作,获得更高质量的gDNA,我们采用水浴法替代二甲苯进行脱蜡,亲和层析纯化石蜡包埋肝细胞癌(HCC)组织标本中基因组DNA,以纯化gDNA为模板PCR扩增看家基因.结果显示改良水浴法提取的gDNA质量、数量均显著高于传统二甲苯脱蜡法,PCR产物量也得到显著提高.与传统方法相比,改良水浴法简单、快捷,可以更有效的回收石蜡包埋组织中的gDNA.

三种全血提取基因组DNA方法的比较及Genomix方法的改良

目的 :选择一种高效、简便快速、价格合适的从全血中提取基因组DNA的方法。方法 :分别采用 3种不同的方法从全血中提取基因组DNA ,比较了 3种方法提取的DNA的质量 ,以及各种方法所需时间及其费用。对其中的一种方法进行了改良。结果 :3种方法提取的DNA的质量都能达到相关分子生物学实验的要求 ,但在操作程序、价格等方面存在差别。结论 :Genomix法操作简单、快速、灵活性好、价格便宜 。

海岛棉基于双色FISH的核型分析

以45S r DNA作探针对海岛棉体细胞中期染色体进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization,FISH),检测出6个强的荧光信号(4大2小),结合DAPI图像观察发现信号分布在各自染色体随体位置,称为NOR(Nucleolar Organizer Region)信号。以二倍体A基因组棉种亚洲棉基因组DNA(g DNA)为探针对海岛棉进行FISH,结果发现52条染色体中有无杂交信号的各占一半,荧光信号分布在较长的A亚组染色体上,直接区分开海岛棉A、D亚组染色体,直观证实了海岛棉的异源双二倍体起源。以45S r DNA和A组棉种亚洲棉g DNA作探针对海岛棉进行双色FISH时,结果发现海岛棉染色体上既检测到了6个强的NOR信号又检测出了g DNA杂交信号,且清楚观察到2个NOR信号分布在A亚组上,另4个在D亚组上。基于该双色FISH图像的核型分析表明,海岛棉的核型公式为:2n=4x=52=40m(2 SAT)+12sm(4 SAT),属于2A类型,且有3对随体,其中1对定位于A9号染色体,属于中部着丝点(m)类型;另2对分别定位于D8和D12号染色体上,属于近中部着丝点(sm)类型;且发现海岛棉A亚组染色体的相对长度的并非全部大于D亚组,两亚组染色体间在长度上存在交叉,说明基于FISH的核型分析比传统方法更为准确。

籽粒苋C_4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是C4途径的关键酶之一。本研究克隆了双子叶植物籽粒苋(A.hypochondriacus L.)C4型PEPC基因的cDNA和gDNA全长序列。该基因编码区cDNA全长2895bp(GenBank登录号为HQ186302),编码964个氨基酸残基。对应的gDNA全长为6785bp,含10个外显子和9个内含子,内含子总长3890bp,其中第一内含子最长,为1662bp,具GATA-motif、G-box等15个光应答元件,9个激素应答元件,29个CAAT box,72个TATA box。该特征在本研究范围内的植物中,为籽粒苋所独有。比较多种植物表明,不同植物之间的C3/C4型PEPC基因的外显子长度具有较高的一致性,而内含子的长度变化较大。不同植物PEPC基因对核苷酸具有一定的选择性,并且外显子和内含子的GC含量呈正相关。总的趋势是单子叶植物外显子和内含子的GC含量均高于双子叶植物。利用半定量RT-PCR分析表达模式,发现籽粒苋PEPC基因主要在叶片中表达,表达量随光照时间延长而增加。

香蕉枯萎菌基因组DNA提取方法的研究

以香蕉枯萎菌菌株为试验材料 ,在SDS -CTAB法和高盐沉淀法等基础上加以改进 ,对两种提纯香蕉枯萎菌基因组DNA的方法进行了比较研究。结果表明 :高盐沉淀法是适合于香蕉枯萎菌基因组DNA提取的方法。该方法提取的DNAOD2 60 /OD2 80 的比值为 1.84 1,DNA产量为 0 .81mgDNA/g菌丝体。基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳得到一条带型较宽且清晰的DNA谱带 ,基本无DNA碎带 ;将提取的DNA直接用于PCR扩增 ,得到带多而且清晰、整齐。

小麦基因组DNA的分离及RAPD反应体系的研究

对普通小麦不同部位提取基因组DNA的方法进行分析比较,发现用黄化苗基因组DNA叶片提取的基因组DNA的质量和浓度均较好,可用于RAPD分析。并对小麦基因组DNA的RAPD反应优化过程中一些重要参数进行了探索、优化试验,建立了随机扩增多态性DNA分析应用反应体系。

水稻二化螟和三化螟基因组ddRADseq文库的构建

本文介绍了构建水稻二化螟和三化螟"双酶切限制性酶切位点关联DNA测序"(Double digest restrictionsite associated DNA sequencing,ddRADseq)文库的方法。利用安捷伦2100生物分析仪对4种单酶切及2种双酶切的酶切产物片段大小及分布范围进行分析,筛选出Mlu C I和Nla III两种限制性内切酶组合对螟虫基因组DNA进行酶切。酶切后的DNA片段两端连接上特定的P1、P2接头后,用Pippin Prep回收大小为285-435 bp的DNA片段。通过PCR扩增进行文库的富集并引入index序列。构建好的ddRADseq文库用琼脂糖凝胶电泳和生物分析仪进行质量检测。本方法所构建的文库DNA片段长度、分布和摩尔浓度能够达到Illumina平台测序的技术要求。本研究证实了利用Mlu C I和Nla III组合酶切构建水稻螟虫基因组ddRADseq文库的可行性,为在水稻螟虫中利用ddRADseq技术开展生物地理学、种群遗传学和系统发育重建等方面的研究奠定基础。

番茄灰霉病生防融合子基因组DNA提取方法的研究

以番茄灰霉病生防菌株木霉T-23和链霉菌A的融合子为实验材料,在SDS-CrAB法、改进CTAB法和氯化苄法的基础上加以改进,比较和研究了真菌融合子基因组DNA的提取,找到了一种快速、高效的基因组DNA提取方法,为进一步对融合子进行生防机制和分子生物学水平的研究提供基础。结果表明SDS-CTAB法提取的基因组DNA OD_(260)/OD_(280)为1．909,DNA浓度约为42．0ng/μL,可以满足分子生物学实验的需要。并将提取的基因组DNA直接用于PCR扩增,得到了多态性的RAPD图谱。

梅花类黄酮3′-羟化酶基因片段基于基因组DNA的简并PCR法克隆(英文)

用本研究设计的“预先去杂—SDS法”从梅花嫩叶提取到高质量的基因组DNA。根据11条已公开发表的并提交到GenBank的类黄酮3′-羟化酶基因cDNA的假定氨基酸序列的保守区设计2个正向简并引物和3个反向简并引物组成6对引物,仅有1对引物能以PCR法同时从梅花‘南京红须’、‘南京红’和‘粉皮宫粉’的基因组DNA扩增到一个469 bp的核苷酸片段,这3个片段在总体上有99 .72 %的一致性,与11条类黄酮3′-羟化酶基因cDNA的相应区域有65 .57 %的一致性。同时,“GGEK”并非类黄酮3′-羟化酶的特征性模体。这是首次从木本植物的基因组DNA克隆到类黄酮3′-羟化酶基因片段。本研究结果可为梅花类黄酮3′-羟化酶基因全长的克隆奠定基础。

番茄煤霉病生防融合子基因组RAPD分析鉴定

RAPD分子标记以其快速、简便等优点,克服了传统的标记手段和形态分类学的缺点,在亲本和杂交种的鉴别以及在基因克隆与分离和遗传图谱的建立等研究中都起着重要的作用。以番茄煤霉病生防菌株木霉菌T-23和链霉菌A的融合子为实验材料,比较和研究了真菌融合子基因组DNA的提取。并用20个随机引物对亲本及其融合子进行RAPD分析。结果表明,SDS-CTAB法提取的基因组DNAOD260/OD280为1.909,DNA浓度约为42.0 ng/μL,可以满足分子生物学实验的需要;融合子是双亲融合的产物,但从双亲获得的遗传信息不等,融合子在DNA水平上更接近链霉菌。

SLuCUT-A全自动激光显微切割系统植物染色体切割的研究

SLuCUT-A全自动激光显微切割是目前比较先进高效的染色体微切割、微分离和微收集系统。为使高精尖仪器设备在植物染色体遗传分析中广泛应用,此研究利用SLuCUT-A全自动激光显微切割系统对普通小麦"中国春"和中间偃麦草染色体进行了微切割、微收集和微克隆,并且以回收到的切割染色体(或染色体片段)为模板进行了DOP-PCRDNA扩增。