基于gE蛋白的羊伪狂犬病病毒间接ELISA的建立与应用

为建立羊源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)抗体的检测方法,从PRV中对gE基因进行克隆,并构建重组载体对gE蛋白进行原核表达,以重组gE蛋白为包被抗原,建立PRV抗体间接ELISA检测方法,并进行临床样本检测。结果显示,重组gE蛋白大小为42 ku,以包涵体形式表达;Western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白作为包被抗原的最佳工作浓度为1μg/mL,待检血清100倍稀释,以HRP标记的兔抗山羊IgG 10000倍稀释作为二抗;检测临床样本时判定阴阳性的临界值为0.284;灵敏性试验结果显示,羊PRV阳性血清稀释2048倍时检测结果仍为阳性;批内变异系数(2.45%~5.00%)与批间变异系数(2.55%~7.41%)均小于10%;采用建立的方法检测其他常见羊源病毒阳性血清结果均为阴性;对收集的376份临床羊血清进行检测,PRV阳性率为10.6%。建立的间接ELISA检测方法可用于羊源样本中伪狂犬病病毒抗体的检测,该方法的建立为羊场PRV抗体检测提供了技术支持。

Advances in Research and Application of gE Gene/Protein in Prevention and Control of Swine Pseudora-bies

Research and application progresses of gE gene and its encoding gE protein in PR vaccines, diagnostic technique and epidemiological investigation are summarized, which have certain reference value for comprehensive prevention and control of PR and gradual purification of PR in different regions.

猪伪狂犬病病毒gE蛋白原核表达及野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立一种简单、快速的猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒抗体检测方法,试验采用原核表达技术对PRV流行毒株的gE蛋白进行了原核表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA检测方法。结果表明:获得了以包涵体形式表达的重组gE蛋白,经Western blot鉴定表明重组gE蛋白具有良好的免疫学活性,以该蛋白作为包被抗原建立的检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法检测PRV疫苗免疫血清、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV、FMDV阳性血清均为阴性,检测PRV野毒阳性血清的最低检出效价为1∶10240,批内和批间重复性试验的变异系数分别为2.19%~3.33%和3.01%~4.40%,与国外商品化gE-ELISA试剂盒的符合率达98.72%,应用该ELISA检测河南省部分地区采集的1128份猪血清样品,PRV野毒抗体阳性率为8.07%。说明建立的PRV野毒抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,为PRV野毒抗体的流行病学监测和净化提供了技术支持。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白的真核表达及其活性鉴定

为制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gE重组蛋白并评估其抗原活性,将优化的PRV gE基因胞外区插入真核表达载体pCMV并在其C端加入Hexa-His标签,构建真核表达质粒pCMV-gE;将重组质粒转染HEK293F细胞,Dot blot鉴定转染细胞中gE重组蛋白的分泌表达;利用镍亲和层析和凝胶过滤层析从转染细胞培养上清中纯化gE表达蛋白;以SDS-PAGE和Western blot鉴定gE重组蛋白,利用PRV阳性血清以ELISA分析gE重组蛋白的抗原活性,通过去糖基化酶PNGase F鉴定其糖基化修饰及其对抗原活性的影响。Dot blot结果显示,gE重组蛋白通过自身信号肽实现在细胞培养上清的分泌表达,其表达量在转染96 h达到峰值。SDS-PAGE和Western blot结果显示,从细胞培养上清中纯化获得gE重组蛋白纯度约为90%,经去糖基化酶PNGase F处理的gE重组蛋白分子质量显著降低。间接ELISA结果显示,gE重组蛋白检测PRV阳性血清的抗体效价为1∶12800;PRV阳性血清对gE蛋白的检出限为31.25 ng/mL,其抗原活性是原核表达的4倍。对临床血清的检测结果显示,基于gE重组蛋白的ELISA与IDEXX抗体检测试剂盒的符合率为96.5%。综上,在真核细胞中分泌表达了具有高表达量、高纯度、高活性和糖基化修饰的gE重组蛋白,在PRV感染鉴别检测中具有良好的应用潜力。

牛疱疹病毒1型糖蛋白E(gE)可溶性表达及其反应原性分析

为探索牛传染性鼻气管炎诊断新技术,本研究以GenBank公布的牛疱疹病毒1型(BHV1,NC_001847.1)基因序列为参考,预测并优化了BHV1的gE蛋白胞外区密码子序列。优化后的序列长度为1 275 bp,5’端和3’端分别添加限制性酶切位点SacⅠ和HindⅢ后克隆至载体pUC19,进而构建原核表达载体pET-SUMO-gE,将其转入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达重组蛋白,使用NiNTA亲和柱纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测结果证明,获得的牛疱疹病毒1型gE胞外区重组蛋白大小约为70 kDa,有良好的水溶性和反应原性。该研究结果为gE特异性单克隆抗体的制备及后续诊断试剂盒的研发奠定了基础。

二肽AQ、SQ和IQ增强GES-1细胞对酒精损伤的抵抗能力

部分食源性二肽具有良好的吸收特性以及生理活性,在功能食品的开发上具有强大的应用前景。该研究旨在阐明二肽AQ、SQ和IQ具有增强GES-1细胞对酒精损伤抵抗能力的作用。首先,该研究对GES-1细胞进行二肽预处理,之后,利用酒精建立细胞损伤模型;通过检测细胞存活率和细胞的乳酸脱氢酶释放量判断模型是否成立,通过检测细胞内ROS含量、抗氧化酶活力和氧化损伤标志物含量,评价二肽对细胞氧化应激的改善作用;通过检测细胞内紧密连接蛋白以及相关损伤标志物的蛋白表达水平,评价二肽对细胞屏障功能的增强作用。结果表明,上述3种二肽可以减轻细胞氧化应激,减少损伤标志物的表达水平并增加紧密连接蛋白的表达水平。该研究证明了上述3种二肽可以增强GES-1细胞抵抗酒精损伤的能力,在修复酒精性胃黏膜损伤,保护胃黏膜屏障功能方面具有一定的应用价值和潜力。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白在野毒诊断中的应用进展

猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gE基因缺失弱毒疫苗在中国的大规模免疫应用,对预防和控制猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)起到了重要作用,同时亟需建立与gE基因缺失弱毒疫苗配套的鉴别诊断技术,淘汰净化野毒感染猪,减少免疫猪被误杀的可能,逐步实现PRV的净化。随着分子生物学与免疫学技术的日臻进步,基于PRV gE蛋白的分子生物学和血清学诊断方法不断发展与完善。文章就近年来基于gE蛋白的各种分子生物学和血清学诊断方法的最新研究现状及发展前景进行综述,以期为中国PRV的诊断与防控提供科学依据。

伪狂犬病病毒gE基因的表达及gE蛋白单克隆抗体的制备

以猪伪狂犬病病毒(PRV)Min-A株pMD-gE质粒为模板,利用所合成的特异性引物进行PCR扩增,获得了1 000 bp的DNA片段,并将其克隆至表达载体pET-30a中,转化到大肠杆菌中进行了原核表达,对表达产物进行了抗原性分析;在此基础上,用纯化的gE蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选和鉴定了分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株。结果显示,原核表达的gE蛋白具有良好的抗原性,其分子质量为46 ku。筛选获得3株分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株,Western-blot和间接免疫荧光试验证实,所获得的3株单抗具有良好的特异免疫反应原性。3株单抗均为IgG1亚类,且轻链均为κ链。

猪伪狂犬病病毒HeN1株gE蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E(gE)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以原核系统表达PRV HeN1株截短的gE(aa127~aa232)蛋白(rgE),并对表达的rgE进行纯化免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,以该病毒感染的Vero E6细胞及真核表达的gE蛋白为检测抗原,采用IFA检测方法筛选杂交瘤细胞系,获得一株稳定分泌抗PRV gE的MAb杂交瘤细胞系(mgE185)。该MAb亚型鉴定为Ig G1型,轻链为Κ链。该MAb不具有中和病毒的活性,其细胞培养上清及腹水IFA效价分别为1∶80和1∶2 560。Western blot试验显示mgE185可以特异性识别gE蛋白,表明其针对的抗原表位为线性表位。通过截短表达gE蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为^(151)IGDYL^(155),该抗原表位在PRV中高度保守。本研究制备的MAb为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRV gE-ELISA检测方法奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

以原核表达的猪伪狂犬病毒gE蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法并进行相应优化,研制出了猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,并与国内市场标杆产品进行比较,发现阳性符合率为88.03%,阴性符合率为91.47%,总体符合率达到89.84%。同时,该试剂盒批间、批内变异系数均小于10%,具有较好的重复性。该检测试剂盒的研制,可为猪场猪伪狂犬病毒野毒感染的检测提供技术支撑。

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的克隆与表达

为了克隆表达牛传染性鼻气管炎病毒gE因,根据牛传染性鼻气管炎病毒(infectious Bovine rhinotraeheitis virus,IBRV)全基因组序列设计合成gE因的特异性引物,采用PCR方法扩增gE基因,并将其克隆至pGEM-T3载体。然后对携带gE因的质粒进行双酶切处理,连接到经相同酶切处理的原核表达载体pET-32a,进而转化宿主菌BL21(DE3),通过获得阳性菌落进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE对蛋白表达及纯化情况进行分析。SDSPAGE电泳结果显示,表达产物融合蛋白大小约为87kD,与预测值相符。利用Ni层析柱纯化重组蛋白,Western-blot和ELISA鉴定纯化的重组蛋白浓度为0.4mg/mL(0.123A)。在大肠杆菌中成功表达了pET-32a-gE融合蛋白,纯化后通过免疫印迹分析具有良好的免疫原性。

传染性鼻气管炎病毒gE基因的表达与免疫原性

[目的]对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gE基因表位进行原核表达,并对表达产物进行免疫原性鉴定。[方法]利用PCR扩增出gE基因2段表位(gE-A、gE-B),并构建原核表达重组质粒pET-32a-gE。将其转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达。表达的gE重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Westernblot分析。[结果]重组表达质粒pET-32a-gE经过PCR、双酶切及测序证明成功构建重组质粒。SDS-PAGE结果表明,gE蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约52ku,与预期蛋白分子量一致。纯化后的gE重组蛋白浓度为0.254mg/mL。免疫印迹结果表明,纯化后的gE重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好。[结论]成功表达了gE基因表位蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可作为检测IBRV的gE抗体的候选抗原。

伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备伪狂犬病病毒变异株gE蛋白的单克隆抗体,PCR扩增伪狂犬病病毒gE蛋白主要抗原表位区的基因片段,并将其克隆至原核表达载体p Cold-TF。经1 mmol/L IPTG低温诱导,表达了约90 k Da的gE融合蛋白。融合蛋白用镍离子金属亲和层析柱纯化后,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,经细胞融合和筛选,获得了2株稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞(5B2和6E6)。间接免疫荧光试验(indirect immunofl uorescence assay,IFA)显示2株单克隆抗体均能与PRV变异株(JS-2012)反应,但与gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株无反应。Western blot结果显示5B2和6E6与gE蛋白不反应,提示2株单克隆抗体针对的可能是gE蛋白的构象表位。本研究获得的gE蛋白单克隆抗体为伪狂犬病病毒变异株的鉴定与功能研究以及野毒株和疫苗株的鉴别诊断提供了良好的工具。

猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子量约为44 kDa,pET32a-gE蛋白分子量约为41 kDa。分别以gB和gE重组蛋白作为包被抗原,建立了PRV抗体间接ELISA检测方法。该方法中重组蛋白仅与PRV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可用于PRV抗体的监测,鉴别疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪伪狂犬病净化工作。

猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的建立

为了制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白gE的单克隆抗体并制备竞争ELISA猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒,以原核表达系统表达PRV FA株囊膜蛋白gE的主要抗原表位区段(aa52~aa238)的His标签,获得了融合蛋白gE-6×His;将gE-6×His纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾脏制备脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),进行细胞融合,以感染PRV的PK15细胞的蛋白为样本检测抗体,使用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞系,获得了2株稳定分泌抗PRV gE单克隆抗体的杂交瘤细胞系。结果显示:制备的抗体特异性好,效价为1∶5120;以单克隆抗体为检测抗体建立的竞争ELISA抗体检测方法灵敏、特异。

猪伪狂犬病病毒流行株gE蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在获得重组伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白及其多克隆抗体。利用PCR方法从PRV感染猪的肺脏、脑和扁桃体混合组织中扩增PRV gE基因,连接至克隆载体pMD18-T(pMD-gE)后进行测序与进化树分析。以pMD-gE为模板,利用PCR方法扩增其膜外结构域部分基因(gE-outside),将其连接至原核表达载体pET-30a(+),转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-gE-outside。将重组质粒pET-gE-outside转化大肠杆菌Rosetta TM(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行表达产物的分析与鉴定。经亲和层析技术纯化重组PRV gE蛋白并免疫小鼠,通过间接ELISA和Western blotting分别进行三免3周血清中鼠抗PRV gE多克隆抗体效价的测定和鉴定。PCR和测序结果表明,本研究成功克隆了PRV gE基因,与国内2011年以后流行毒株属于相同分支。SDS-PAGE和Western blotting结果证实,PRV gE-outside基因在原核表达系统获得正确表达,分子质量约为55 ku,且可与猪抗PRV多克隆抗体发生免疫反应。经亲和层析纯化的gE-outside蛋白浓度为1.23 mg/mL。将其免疫小鼠,三免3周的小鼠血清中鼠抗PRV gE-outside多克隆抗体效价为1∶204800,并可与gE-outside蛋白发生免疫反应。综上,本研究制备了重组PRV gE蛋白和鼠抗PRV gE蛋白多克隆抗体,可为PRV感染机制研究及建立快速、高效免疫学检测技术提供技术指导和材料。

细胞毒力因子CagA上调人胃黏膜上皮GES-1细胞TET2蛋白的表达

目的:探讨幽门螺旋杆菌细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated gene A,CagA)与胃黏膜中TET2(ten-eleventranslocation 2)蛋白表达的关系,以及TET2在CagA致癌过程中可能的作用。方法:Real-time PCR检测人胃黏膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株MGC-803中TET2 mRNA的表达水平,细胞免疫染色法检测TET2蛋白的细胞定位及表达。将pEGFP-CagA通过脂质体介导转染GES-1细胞,用200μmol/L H2O2处理GES-1细胞建立氧化应激模型,流式细胞仪检测细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)和细胞周期的变化。结果:TET2 mRNA在GES-1细胞的表达水平低于胃癌MGC-803细胞(1.00±0.08 vs 1.68±0.07,P<0.05),TET2蛋白在GES-1细胞表达水平低于胃癌MGC-803细胞(8.09±3.57 vs14.60±2.31,P<0.05)。与阴性对照组pEGFP-N1相比,pEGFP-CagA转染组GES-1细胞中TET2 mRNA表达水平升高(1.00±0.04 vs 0.06±0.00,P<0.05),TET2蛋白表达水平也升高(16.45±4.40 vs 10.82±3.39,P<0.05),ROS积累水平升高(18.39±4.52 vs 15.31±4.40,P<0.05),细胞周期检测出现明显的凋亡峰。氧化应激(H2O2处理)模型中GES-1细胞与空白对照GES-1细胞相比,TET2 mRNA水平升高(1.44±0.02 vs 1.00±0.04,P<0.05),TET2蛋白表达水平增高(15.72±4.52vs 11.74±4.34,P<0.05)。结论:幽门螺旋杆菌毒力因子CagA可诱导GES-1细胞ROS增高和细胞周期的失衡,氧化应激可以诱导TET2表达上调,TET2可能参与CagA的致癌过程。

水痘带状疱疹病毒gE-Foldon融合蛋白的表达及免疫效果的分析

水痘带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)是引起全球老年人带状疱疹(Herpes zoster,HZ)的主要病原体,VZV gE蛋白是诱导机体产生免疫应答的主要结构蛋白,基于gE蛋白设计的重组蛋白疫苗Shingrix已经在我国批准上市。多种研究表明聚体蛋白可以诱导更强的免疫应答,本研究应用中国仓鼠卵巢细胞CHO-S表达连接Foldon结构域的蛋白(gE-Foldon)、连接Fc片段的蛋白(gE-Fc)和gE蛋白。三种抗原(gE-Foldon、gE-Fc和gE)分别联合AlOH+CpG佐剂,比较在BALB/c小鼠中的免疫效果,同时,将商品化的Shingrix作为对照。SDS-PAGE和WB结果显示成功表达纯化三种抗原,非还原条件下可以观察到gE-Foldon以三聚体形式存在。与gE和gE-Fc抗原相比,gE-Foldon在小鼠中诱导产生的IgG抗体(40492)和中和抗体滴度(1190.5)最高(P<0.01),与Shingrix相当。此外gE-Foldon诱导小鼠产生的分泌IL-2、IL-4的淋巴细胞数量显著高于其他免疫组(P<0.0001,P<0.05)。综上所述,gE-Foldon蛋白联合AlOH+CpG佐剂可诱导较强的体液和细胞免疫应答,因此可以作为预防HZ的潜在候选疫苗。

IL4I1影响肝细胞癌发生发展的研究

目的:探讨肝细胞癌组织中白细胞介素4诱导蛋白1(IL4I1)的表达及其临床价值。方法:从TCGA公共数据库中下载肝细胞癌的相关样本资料,使用R软件和Perl软件进行数据分析整理,采用Wilcoxon秩和检验分析基因IL4I1在正常组织和肝细胞癌组织中的差异表达以及与临床病理特征的相关性,经单因素和多因素Cox回归分析肝癌患者预后的影响因素。以基因集富集分析(GSEA)方法分析基因IL4I1的调控网络,探究潜在机制。计数资料采用中位数(四分位数间距)表示。结果:基因IL4I1在肝细胞癌组织中的表达量显著高于正常组织﹝0.69(0.31,1.75)比0.22(0.15,0.51),P<0.05﹞。IL4I1表达量与肿瘤的组织学分级﹝G_(1)、G_(2)、G_(3)、G_(4)分别为0.31(0.19,0.76)、0.75(0.32,1.78)、0.93(0.42,2.14)、0.86(0.46,2.07),P<0.01﹞以及TNM分期中的T分期﹝T_(1)、T_(2)、T_(3)、T_(4)分别为0.66(0.30,1.52)、0.92(0.36,2.79)、0.64(0.26,1.92)、1.57(0.84,2.91),P<0.05﹞呈正相关。GSEA提示,IL4I1参与了自然杀伤细胞介导的细胞毒性作用、细胞因子信号通路、抗原处理和提呈途径、T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路和Notch信号通路。结论:IL4I1在肝细胞癌组织中呈高表达,与患者的不良预后密切相关,其可能通过JAK-STAT信号通路和Notch信号通路促进肝细胞癌的发生和发展。