PRV FB株gE/gI基因缺失株的构建及其灭活疫苗免疫保护效力评价

自2011年以来,新型伪狂犬病病毒(PRV)变异株在我国免疫猪场不断出现,导致目前商品化疫苗免疫效果不佳。为研究PRV FB株gE/gI基因缺失株疫苗防控新型PRV变异株感染的效果,本研究以PRV自然弱毒FB株作为亲本株,通过同源重组的方法构建了PRV g E/gI基因缺失株,将不同代次PRV FBΔgE/gI株与亲本PRV FB株分别接种BHK-21细胞,观察CPE和测定TCID50效价,分析缺失株的遗传稳定性,结果显示FBΔgE/gI株感染BHK-21细胞后产生与亲本株FB相似的CPE,且不同代FBΔgE/gI株的TCID50与亲本株相比均无明显变化。将FB株、FBΔgE/gI株、Bartha-K61株分别接种健康新西兰兔,比较三者的安全性,结果显示,接种BarthaK61株的家兔全部死亡(5/5),接种FB株的家兔死亡2只(2/5),而接种FBΔgE/gI株的家兔全部(5/5)健活,表明FBΔgE/gI株对新西兰兔的致病力较低,安全性更高。将FBΔgE/gI株分别与水相佐剂GEL02和两性佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊28 d后,采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以PRV变异株FJ-2012攻毒,评估FBΔgE/gI株灭活疫苗对绵羊的保护效力,结果显示,接种GEL02和ISA 206为佐剂的FBΔgE/gI灭活疫苗绵羊在免疫后28 d,抗体均全部转阳;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02作为佐剂的灭活疫苗组绵羊死亡2只(2/5),而以ISA 206为佐剂的绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,表明以ISA 206作为佐剂的FBΔgE/gI株灭活疫苗能够完全保护绵羊抵御PRV变异株的攻击。本研究首次基于PRV自然弱毒FB株构建的FBΔgE/gI株,与Bartha-K61株相比具有更高的安全性,与佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊后能够完全抵抗新发变异PRV的攻击,具有完全保护作用。本研究为我国新发变异PRV疫苗的研发提供了新的参考依据。

伪狂犬病病毒TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪毒力稳定性检测

旨在明确伪狂犬病病毒(PRV)TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪的安全性。试验选择21~28日龄PRV阴性健康仔猪,通过病毒接种感染试验,观察ZJ01R在仔猪体内的分布规律及不同代次病毒对仔猪致病性。试验结果显示,仔猪肌肉注射ZJ01R后无明显临床症状,鼻腔排毒3~6 d,免疫后7、14、21 d,猪脑组织检测到PRV,其他组织均无病毒。仔猪滴鼻和肌肉注射F5、F30和F35代次ZJ01R病毒液,体温正常,无明显临床症状和病理变化,无病毒血症,鼻腔排毒时间仅为6 d;仔猪接种后7和14 d,肝脏和肺脏组织病毒检测均阴性,脑组织病毒核酸阳性;感染仔猪血清PRV gB ELISA抗体阳性,gE ELISA抗体阴性,表明ZJ01R毒株35代内对仔猪无临床致病作用,病毒毒力稳定性较好。

伪狂犬病病毒gE/gI基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)UL区基因序列(KJ789182)设计2对特异性引物,扩增PRV NY株TK基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,然后绿色荧光蛋白标记基因,构建转移质粒pUCTKLRE。用转移质粒pUC-TKLRE和PRV双基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-DNA共转染ST细胞,通过蚀斑纯化,获得表达荧光蛋白的PRV三基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。经PCR鉴定及测序,证实获得的三基因缺失株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+在TK基因上缺失了311bp。该病毒与亲本株PRV NY在ST细胞上培养时,具有相似的生长曲线,但其体外生长动力学比亲本株弱;且对非靶标动物小鼠是安全的。结果表明,本试验釆用同源重组,同时结合蚀斑克隆纯化技术,成功构建了1株以目前PRV流行变异株为亲本株的gE/gI/TK三基因缺失病毒,为防控当前PRV变异毒株的疫情、根除PR提供技术支持。

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE^-/gI^--EGFP^+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE^-/gI^-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。

鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

伪狂犬病毒gE、gI和US9三基因缺失株的构建

伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)是一种疱疹病毒,在自然界具有极广泛的宿主类群,是中国养猪业发展主要威胁之一。为了研究病毒的神经传导机制,实验采用Lipofectamine3 000转染试剂,将PP63质粒与伪狂犬病毒Fa株基因组DNA共转染BHK-21细胞,空斑筛选得到gI/gE/US9重组缺失病毒,并命名为SA215-T。采用PCR、基因测序、Western Blot、电镜检查和生长曲线测定等方法检测重组病毒PRV-SA215-T。研究结果显示,Western Blot未发现gE基因的表达,SA215-T株的电镜形态与野毒株无明显差异,SA215-T株与亲本毒株Fa株在细胞中的生长曲线差异不明显且均达到了较高的病毒滴度。

伪狂犬病毒Sa株gI^-/gE^-/YFP^+基因缺失载体构建及突变株筛选

根据伪狂犬病病毒SA株的gI和gE基因序列,设计两对引物,缺失掉gE基因5'端738bp,在克隆测序的基础上,采用酶切方法构建了含部分gE基因的转移载体pBgIE,同时将pBLYFP载体上含CMV启动子、多克隆位点、黄色荧光蛋白(YFP)基因和polyA尾巴的表达盒双酶切后插入到缺失位置,构建转移载体,命名为pBgIE-YFP,为下一步开发以伪狂犬病病毒为载体的基因工程疫苗提供了基础。

单纯疱疹病毒Ⅰ型gE/gI复合物研究进展

单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)是人疱疹病毒成员,属于α-疱疹病毒亚科,可引起口唇性疱疹、疱疹性脑膜炎和疱疹性角膜炎等疾病,严重威胁人类健康。gE/gI复合物是HSV-1 gE和gI蛋白相互作用形成的多功能异源二聚体,在HSV-1生命周期的多个环节发挥重要作用。本文总结了gE/gI复合物在HSV-1病毒次级包被和释放、胞间传递及免疫逃逸过程中的功能与机制,旨在为HSV-1的防治和gE/gI复合物的深入研究提供参考。

猪伪狂犬病病毒TK/gE/gI缺失株的构建及与Montanide Gel 01佐剂联合免疫效果评价

自2011年以来,伪狂犬病病毒(PRV)变异株在我国免疫猪群中大面积流行,对养猪业造成了严重经济损失,且在我国广泛使用的Bartha K-61疫苗已不能为猪群提供完全有效的保护。因此,本研究以rPRV-AH-gE-/gI-为亲本毒株,通过同源重组对TK基因进行缺失,构建了rPRV-AH-TK-/gE-/gI-三基因缺失重组病毒,并对其生物学特性进行了评价。将该病毒单独或与Montanide Gel 01(MG01)佐剂联合免疫小鼠,通过血清中和抗体试验和攻毒保护试验评价了其对小鼠的免疫保护效果。结果显示,重组病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-构建成功,且有良好的遗传稳定性和生长性能。动物试验结果表明,重组病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-与佐剂MG01联合免疫效果更好,其中106 TCID50 rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01组与106 TCID50 rPRV-AH-TK-/gE-/gI-组相比,小鼠血清中和抗体水平显著升高(P<0.001);在用106 TCID50 PRV-AH攻毒时,无论免疫剂量为106 TCID50或105 TCID50,rPRV-AH-TK-/gE-/gI-与MG01联合免疫均可为小鼠提供100%的保护力。

伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究

对PrVEaTK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明,该基因缺失疫苗105 0TCID50和106 0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的,并可保护妊娠母猪抵抗107 1TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后,gE鉴别ELISA试验表明,PrVEaTK-/gE-/gI-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以105 0TCID50和106 0TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物,结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象,说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。

伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株的生物学特性

为了解gE和gI双基因缺失株伪狂犬病病毒gE-/gI-PRV SA738和野毒株PRV-SA的生物学特性,对该病毒进行了理化特性和体外增殖曲线的研究。结果显示:该缺失株对氯仿、酸、热及冻融次数敏感,从双基因缺失毒株与野毒株在BHK-21细胞上的增殖曲线来看,在病毒培养50h之前野毒株的毒价均高于缺失株,而在50h以后缺失株的毒价又高于野毒株,并且在36h时2株病毒的毒价均达到最高峰。

基于GE Smallworld GIS的配电网停电管理子系统的研究与设计

分析了配电网停电原因与分类,设计出停电工作流程,详细阐述利用GIS技术设计配电网停电子系统的实现过程.该系统综合应用实时信息使停电信息报告更准确,供电恢复更快,从而减少了停电带来的损失和影响,可实现对配电网的高度自动化管理.

猪伪狂犬病病毒变异株TK/gE/gI三基因缺失突变株在小鼠体内的免疫原性

应用PCR方法扩增了猪伪狂犬病病毒(PRV)NY株TK基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,同时插入绿色荧光蛋白标记基因,构建转移质粒pUC-TKLRE,并与PRV变异株gE/gI双基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-的基因组DNA共转染ST细胞,通过蚀斑纯化,获得表达荧光蛋白的PRV三基因缺失突变株。分别用PRV三基因缺失突变株、rPRV NY-gE-/gI-、PRV商品活疫苗Bartha-K61株、DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性小鼠,2周后对小鼠进行第2次免疫,且首免后6周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒试验。结果显示,成功拯救PRV三基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+,且对小鼠是安全的。间接ELISA试验和病毒中和试验证实rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+使小鼠机体产生了较高滴度的PRV特异性抗体,小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定证明,其诱导小鼠机体产生了细胞免疫应答。攻毒试验结果显示,rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+对PRV强毒NY株的攻击具有一定的抵抗力。本试验获得的PRV三基因缺失病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+有望成为一种防控当前PR流行的疫苗株。

猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失株rPRV NY-gE^-/gI^-/TK^-的纯化及生物学特性

将猪伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pUC-TKLR与含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的gE/gI/TK三基因缺失PRV变异株rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-/EGFP+基因组经脂质体转染至ST细胞中,进行无荧光重组病毒蚀斑筛选、纯化,并对该病毒在多种细胞上增殖特性、病毒滴度、一步生长曲线和遗传稳定性及其对小鼠的安全性等进行初步研究。结果显示,成功获得重组病毒rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-,不含EGFP。经PCR及测序鉴定,证实获得的rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-在TK基因上缺失311 bp。rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-在ST、PK^-15、VERO和MDCK细胞上的TCID50分别为106.375/0.1 mL,105.625/0.1 mL,105.375/0.1 mL,103.875/0.1 mL;与亲本毒株NY在ST细胞中的毒力(106.5/0.1 mL)相近;当rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-传至20代时,病变细胞仍无绿色荧光,缺失部分TK基因(311 bp),且对小鼠是安全的。

伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的构建

在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部分 ,并在下游引入一个多克隆位点 ,构建了缺失转移载体pgEI GFP。用DOTAP转染试剂盒将pgEI GFP转染了感染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的缺失了gE gI重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。

基于GE Smallworld GIS的停电分析系统研究

本文提出了基于GE Smallworld GIS的停电分析系统,它是建立和维护从变电站至用户馈线连通性模型的工具。该系统可对配电网有关信息进行地理聚焦定位,可在GIS视图中进行停电范围分析和模拟停电分析,是配电网操作人员的一个决策支持工具。在综合环境中它可与企业的其它信息系统相互作用,是配网综合停电管理系统成功设计和实施的关键。研究的结果表明,该系统有很好实用价值,在停电管理方面的性能非常好。

伪狂犬病病毒上海株gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的生物学特性初步研究

在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体 pgEI-GFP 基础上,将 pgEI-GFP 转染感染了 PRV-SH 株的 BHK-21细胞,待出现 80%以上的细胞病变时收获病毒,并以绿色荧光蛋白为标志,通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE-/gI-/GFP+ 缺失株。研究了该缺失株的的安全性、在细胞上的生长特性以及对断奶仔猪的安全性、免疫原性等生物学特性。试验结果显示,缺失了 gE-和 gI-后,不影响其在 RK 细胞上的生长状况和病毒的滴度。该疫苗株对小鼠的半数致死量比亲本毒低且对家兔的致死性的时间延长了,这表明该疫苗的毒力比亲本毒有所下降。该缺失株对断奶仔猪安全,无不良接种反应,接种断奶仔猪能抵御高剂量 PRV-SH 株强毒的感染,攻毒后试验猪的发热期、散毒天数均低于对照组。该缺失株接种仔猪后在试验期间一直维持较高水平的中和抗体。

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)的gI和gE基因序列 ,自行设计并合成了两对引物 ,对PRV上海株 (PRV_SH)进行PCR扩增 ,产物经琼脂糖电泳分析 ,均呈现一条约 96 0bp和 174 0bp的条带 ,将其克隆入pGEM_T_easy载体中 ,进行了序列测定。将PRV_SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现 ,核苷酸的同源性为 94 .7% ,氨基酸的同源性为91.3% ,证实为gI基因。将PRV_SHgE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较 ,结果显示 ,该序列与PRVEa株、Rice株gE基因的同源性分别为 98.5 %、97.5 % ;推导的氨基酸序列与Ea株 ,Rice株和I型单纯疱疹病毒 (HSV_1) 17株gE的同源性分别为 97.2 %、94 .8%和 15 .6 %。

传染性喉气管炎病毒(ILTV)gI-gE基因的PCR-RFLP分析

根据 ＵＳＤＡ（美国农业部）标准攻毒株 ＩＬＴＶ ｇＩ－ｇＥ基因的序列，在 ＩＬＴＶ ｇＩ基因、ｇＥ基因及 ｇＩ－ｇＥ基因连接部的上下游分别设计了一对引物。以 ＳＤＳ－蛋白酶 Ｋ法提取的 ８株 ＩＬＴＶ ＤＮＡ为模板，分别用这 ３对引物进行 ＰＣＲ扩增，均获得了与预期片段大小一致的ＤＮＡ片段。然后，用４种限制性内切酶（Ａｖａ Ⅱ、ＨｉｎｆⅠ、ＤｄｅⅠ和ＨａｅⅢ）对所有ＰＣＲ产物进行ＲＦＬＰ分析。结果发现， ＨｉｎｆⅠ和 ＤｄｅｌⅠ可以分别将 ８株 ＩＬＴＶ ｇＥ基因的酶切图谱分为两类， ＨａｅⅢ可将 ８株 ＩＬＴＶ的ｇＩ－ｇＥ基因连接部的酶切图谱分为两类。这表明不同的ＩＬＴＶ毒株的ｇＥ基因变异较大，而ｇＩ基因则相对比较保守。