大豆分离蛋白和大豆肽对鼠李糖乳杆菌GG生长代谢的影响

为探究氮源类营养物质对鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)生长和代谢的影响,本研究以模拟胃肠道消化后的大豆分离蛋白和大豆肽为原料,通过单培养的方式分别测定鼠李糖乳杆菌GG的活菌数和乳酸及乙酸产量,并将鼠李糖乳杆菌GG与单增李斯特菌共培养测定其在致病菌存在下利用大豆蛋白和大豆肽的情况。结果表明,在单培养的条件下消化后大豆分离蛋白和大豆肽都能显著提高鼠李糖乳杆菌的活菌数(P<0.05),而消化后大豆肽的作用比消化后大豆蛋白的作用提前4 h,且二者都能显著提高乳酸和乙酸的生成(P<0.05)。在共培养体系中,消化后大豆蛋白显著削弱了单增李斯特菌的竞争能力,提高了鼠李糖乳杆菌的竞争能力,且培养4 h和8 h后,鼠李糖乳杆菌的活细胞数显著高于单培养(P<0.05)。本研究结果将氮源作为具有潜在益生功能的营养物质,为消化后大豆蛋白和大豆肽功能性食品的开发提供理论依据。

鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用

鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒g G蛋白的间接竞争ELISA方法,本研究以原核系统表达ILTV g G蛋白,并采用切胶纯化该重组g G蛋白(rg G)后经western blot检测纯化的rg G (P-rg G)与本研究室制备的g G蛋白单克隆抗体(MAb) 3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示,P-rg G与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200。以P-rg G作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV g G蛋白间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示,P-rg G包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min。将待检样品的抑制率(PI)≥31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID_(50)),再将该病毒2倍倍比稀释(1∶10~1∶2 560)后,以该ic-ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rg G分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1∶320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID_(50)/0.1 m L;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。利用该方法及荧光定量PCR (q PCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60)。q PCR的检测结果显示,阳性检测率为81.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%。本研究建立的ILTV g G蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段。

鼠李糖乳杆菌对老年小鼠术后海马区小胶质细胞激活及Tau蛋白磷酸化的影响

【目的】探讨术前益生菌鼠李糖乳杆菌(LGG)灌胃对麻醉手术老年小鼠海马区小胶质细胞及Tau磷酸化的影响。【方法】18月龄C57BL/6J小鼠30只随机分为3组,10只/组:对照组,麻醉手术组,麻醉手术+鼠李糖乳杆菌组。生理盐水/LGG 109CFU 150μL灌胃,每日1次,连续20 d后接受异氟醚麻醉+剖腹探查手术,术后12 h免疫荧光染色检测海马区小胶质细胞激活状态,ELISA检测IL-6的浓度变化,Western blot检测Tau蛋白磷酸化位点Tau-pS202/pT205和total Tau蛋白表达变化。【结果】对照组海马区小胶质细胞呈静息状态,炎症因子IL-6浓度为(82.08±12.07)pg/mL。与对照组相比,麻醉手术组海马区小胶质细胞活化增生,胞体变大,突起缩短变粗,炎症因子IL-6上升至(123.7±5.72)pg/mL(P=0.000),磷酸化Tau-pS202/pT205蛋白表达量也明显增加(P=0.002)。而与麻醉手术组相比,麻醉手术+LGG组海马区小胶质细胞增生肥大不明显,炎症因子IL-6分泌减少至(96.68±9.59)pg/mL(P=0.008),磷酸化Tau-pS202/pT205蛋白表达量明显下降(P=0.002)。而3组total Tau蛋白表达水平差异无统计学意义。【结论】术前服用益生菌鼠李糖乳杆菌减轻麻醉手术导致的老年小鼠海马区小胶质细胞活化、炎症因子分泌增加、以及Tau蛋白磷酸化水平增加。

猴B病毒gG蛋白的主要特性与B细胞表位预测

为了探讨猴B病毒gG基因编码蛋白作为疫苗候选抗原和ELISA试剂盒研制所需检测用抗原的可能性,本研究从Genbank数据库中获得猴B病毒gG基因序列,采用IEDB、SOSUI等在线分析系统对该基因序列的编码区进行生物信息学分析,并预测gG基因编码蛋白的理化性质、可溶性和表面可及性、跨膜区、抗原表位以及线性B细胞表位等.分析结果表明,B病毒gG蛋白为膜蛋白,具有一个跨膜螺旋,以及较为丰富的β-转角,为可溶性蛋白,蛋白序列中具有多个抗原表位和优势线性B细胞表位,有作为猴B病毒疫苗候选抗原和抗体诊断用抗原的潜力.

伪狂犬病毒PK/gG/GFP重组转移载体的构建和表达

在构建了含伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)湖北株部分PK基因和gG基因转移载体的基础上,利用平端连接的方法将绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达盒插入到缺失的部分,并在下游引入了1个多克隆位点,构建了重组转移载体KGDF.用限制性内切酶鉴定重组转移载体KGDF.根据质粒EGFP C1中的GFP基因序列设计1对引物鉴定GFP表达盒插入的正确性.用脂质体转染试剂盒将KGDF和PRVHB的基因组或病毒共转染BHK 21细胞,在荧光显微镜下将出现病变的荧光斑挑出得到重组病毒.将重组病毒扩大培养后提取基因组鉴定重组病毒中的GFP基因,并通过挑取病变的荧光斑的方法纯化重组病毒.

单纯疱疹病毒2型gG-2“独特区”基因的原核表达及其血清学诊断价值

目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2"独特区"基因(gG-2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2T,并在大肠杆菌中表达gG-2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的gG-2T融合蛋白可以与GST多克隆抗体结合并在46 ku附近出现特异性结合条带。并且能够与确诊的HSV-2患者血清反应,而不与HSV-1患者血清和正常人血清反应。结论获得了HSV-2 gG-2T融合蛋白,它可以与GST多克隆抗体特异性结合并且可以同HSV-2型患者血清特异性反应;获得的gG-2T蛋白为研究以gG-2蛋白作为靶区域的诊断试剂盒和疫苗研发打下实验基础。

鼠李糖乳杆菌GG治疗儿童牛奶蛋白过敏的研究进展

牛奶蛋白过敏是儿童期常见的可累及胃肠道、呼吸道等多器官系统的过敏性疾病。随着人们对牛奶蛋白过敏的认识不断深入,其治疗方式亦趋多样化。本文追踪国内外相关研究进展,对牛奶蛋白过敏的发病机制及目前鼠李糖乳杆菌GG治疗牛奶蛋白过敏的临床研究进展进行综述,介绍儿童牛奶蛋白过敏治疗新方式。

表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性

对含伪狂犬病病毒 ( PRV)鄂 A株 g G全基因 ,PK、g D基因部分编码序列的质粒 p USK进行改造 ,消除其中的 Eco R 位点 ,将通过 PCR扩增的增强绿色荧光蛋白基因 ( EGFP)融合到 g G启动子下游 ,构建了由 g G启动子控制 EGFP表达的 PRV转移载体 pg G- /EGFP+。该转移载体单独转染或同 PRV基因组 DNA共转染 IBRS-2细胞 ,结果单独转染时 EGFP不能表达 ;共转染时 ,6 h就可在荧光显微镜下观察到明显的荧光。

TD1修饰绿色荧光蛋白透皮功能的研究(英文)

TD1作为一种含有11个氨基酸的短肽,具有良好的促进蛋白类大分子透皮的功能.过去的研究显示TD1可以有效协助胰岛素通过皮肤进入循环并最终降低血糖.在本研究中我们构建了一种TD1 N端修饰的GFP融合蛋白(TGFP).我们的实验表明,与TD1与GFP蛋白的混合物相比,TGFP具有更加良好的透皮功能.这一发现为透皮给药研究提供了一条新的途径,并对解释TD1透皮功能具有指导意义.

质谱-色谱技术在早产儿蛋白质代谢中的应用研究

目的利用气相色谱-质谱技术分析早产儿尿液中重要的蛋白质代谢产物(赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、鸟氨酸、延胡索酸、苹果酸)水平,进而探讨早产儿尿代谢产物特点,为早产儿实现合理的肠道内、外营养提供依据。方法收集2016年7月-2017年12月的47例早产儿(胎龄28~36w)及45例同期分娩的正常足月儿(胎龄37~41w)的尿液标本,利用尿素酶预处理-气相色谱-质谱法(UP-GC-MS)测定2组新生儿尿液中的赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、鸟氨酸、延胡索酸、苹果酸的水平。结果早产儿组的尿液中赖氨酸、苯丙氨酸以及组氨酸水平均明显低于足月儿组,差异均有统计学意义(P<0.05)。早产儿组的尿液中鸟氨酸、延胡索酸及苹果酸水平均明显低于足月儿组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论早产儿体内存在低水平蛋白质分解代谢,而足月儿的分解代谢水平较早产儿高。测定尿代谢产物可在临床工作中用于评估新生儿体内代谢状况,从而进一步指导临床实施合理的营养支持方案。

牛传染性鼻气管炎病毒gG iELISA抗体检测方法的建立

为了建立有效鉴别牛传染性鼻气管炎病毒（BoHV-1）gg-／tk-基因缺失疫苗人工免疫和BoHV-1野毒株自然感染的鉴别诊断方法，以BoHV-1gG蛋白为抗原建立了间接ELISA（iELISA）抗体检测方法。根据编码BoHV1gG蛋白的基因序列设计特异性扩增引物，以BoHV1基因组DNA为模板扩增gg基因截短片段，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1并进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot分析表明，gg基因在大肠杆菌BL21（DE3）中呈可溶性及包涵体2种形式表达，纯化的gG蛋白具有良好的反应原性。将可溶性gG蛋白纯化后作为包被抗原，建立了BoHV-1gGiELISA抗体检测方法，并优化了各反应条件。使用该方法与商业化试剂盒BoHV-1gE和gB阻断ELIsA进行比较检测，并与其他5种牛常见病原体的阳性血清进行交叉反应检测，同时进行了该方法的重复性试验、保存期试验及消长规律试验；最后使用该方法对临床1031份牛血清进行了检测，血清流行率为83．71%,4（95%CI：81．30％～85．90％）。结果显示，该方法的阴、阳性血清检测的临界值（S／P值）为0．398，与进口试剂盒比较显示该方法具有良好的诊断敏感性和特异性，且本试剂盒可在1：50倍样本稀释下进行检测，而商业化试剂盒是1：1倍样本稀释检测。此外，该方法分析特异性良好，与其他非相关病原体的阳性血清无交叉反应；检测重复性良好；在4℃条件下可保存6个月。该方法在人工感染BoHV～1野毒株和人工免疫BoHv-1gg-／tk-疫苗株20d后可以明显区分疫苗株免疫和野毒株感染。综上所述，本研究成功建立了BoHV-1 gG iELISA抗体检测方法，敏感性和特异性良好，既可以用于有效鉴别疫苗免疫和自然感染，也可作为BoHV-1的血清学诊断方法。

鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白多克隆抗体的制备及初步应用

以鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)LJS09株基因组为模板,应用PCR方法扩增gG基因的主要抗原性片段,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建pET-30a-gG-gG串联质粒,转化Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达及纯化,获得His-gG-gG重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备抗血清。用ELISA检测抗体效价为1∶104。Western-blot分析结果表明,制备的家兔抗-ILTV gG抗体能与纯化的gG蛋白发生特异性反应,且能检测到内源性gG蛋白。间接免疫荧光试验结果表明,制备的家兔抗ILTV-LJS09gG蛋白的多克隆抗体分别能与ILTV LJS09、HLJ0507、MDJ0442、SD0203、Zhj1298株反应,特异性良好。

鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统的构建

为了比较不同锚钩蛋白基序结合活性,构建新型的鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统。首先,用热酸处理法制备鼠李糖乳杆菌GEM(Gram-positive enhancer matrix,GEM)颗粒,并通过电镜观察、RT-PCR检测和SDS-PAGE检测鉴定其处理效果;同时,利用大肠杆菌表达了锚定蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP并将其与GEM颗粒共同孵育结合;最后,使用免疫印迹、电镜观察、荧光显微镜观察和荧光分光光度法评价鼠李糖乳杆菌GEM颗粒与锚定蛋白的结合效率。结果表明,使用10%的TCA处理鼠李糖乳杆菌得到了灭活的肽聚糖骨架(GEM颗粒),经鉴定其大小形态均一,绝大部分无蛋白残留,3.8×10~6个GEM颗粒样品中的DNA拷贝数仅为32;免疫印迹和荧光显微镜观察均可检测到融合蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP锚定在GEM颗粒上,且结合在GEM颗粒表面的锚定蛋白呈絮状。荧光分光光度计法检测结果显示锚定蛋白PA3-EGFP结合GEM的效率稍高于P60-EGFP,但差异不显著(P>0.05)。以上结果表明由鼠李糖乳杆菌制得的GEM颗粒与锚定蛋白PA3、P60的结合效率良好,可用于构建新型的外源蛋白表面展示系统,进而为后续的细菌样颗粒疫苗的研究与应用奠定基础。