伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究

对PrVEaTK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明,该基因缺失疫苗105 0TCID50和106 0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的,并可保护妊娠母猪抵抗107 1TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后,gE鉴别ELISA试验表明,PrVEaTK-/gE-/gI-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以105 0TCID50和106 0TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物,结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象,说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。

伪狂犬病病毒上海株gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的生物学特性初步研究

在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体 pgEI-GFP 基础上,将 pgEI-GFP 转染感染了 PRV-SH 株的 BHK-21细胞,待出现 80%以上的细胞病变时收获病毒,并以绿色荧光蛋白为标志,通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE-/gI-/GFP+ 缺失株。研究了该缺失株的的安全性、在细胞上的生长特性以及对断奶仔猪的安全性、免疫原性等生物学特性。试验结果显示,缺失了 gE-和 gI-后,不影响其在 RK 细胞上的生长状况和病毒的滴度。该疫苗株对小鼠的半数致死量比亲本毒低且对家兔的致死性的时间延长了,这表明该疫苗的毒力比亲本毒有所下降。该缺失株对断奶仔猪安全,无不良接种反应,接种断奶仔猪能抵御高剂量 PRV-SH 株强毒的感染,攻毒后试验猪的发热期、散毒天数均低于对照组。该缺失株接种仔猪后在试验期间一直维持较高水平的中和抗体。

伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的构建

在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部分 ,并在下游引入一个多克隆位点 ,构建了缺失转移载体pgEI GFP。用DOTAP转染试剂盒将pgEI GFP转染了感染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的缺失了gE gI重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。

伪狂犬病毒Sa株gI^-/gE^-/YFP^+基因缺失载体构建及突变株筛选

根据伪狂犬病病毒SA株的gI和gE基因序列,设计两对引物,缺失掉gE基因5'端738bp,在克隆测序的基础上,采用酶切方法构建了含部分gE基因的转移载体pBgIE,同时将pBLYFP载体上含CMV启动子、多克隆位点、黄色荧光蛋白(YFP)基因和polyA尾巴的表达盒双酶切后插入到缺失位置,构建转移载体,命名为pBgIE-YFP,为下一步开发以伪狂犬病病毒为载体的基因工程疫苗提供了基础。

鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

PRV FB株gE/gI基因缺失株的构建及其灭活疫苗免疫保护效力评价

自2011年以来,新型伪狂犬病病毒(PRV)变异株在我国免疫猪场不断出现,导致目前商品化疫苗免疫效果不佳。为研究PRV FB株gE/gI基因缺失株疫苗防控新型PRV变异株感染的效果,本研究以PRV自然弱毒FB株作为亲本株,通过同源重组的方法构建了PRV g E/gI基因缺失株,将不同代次PRV FBΔgE/gI株与亲本PRV FB株分别接种BHK-21细胞,观察CPE和测定TCID50效价,分析缺失株的遗传稳定性,结果显示FBΔgE/gI株感染BHK-21细胞后产生与亲本株FB相似的CPE,且不同代FBΔgE/gI株的TCID50与亲本株相比均无明显变化。将FB株、FBΔgE/gI株、Bartha-K61株分别接种健康新西兰兔,比较三者的安全性,结果显示,接种BarthaK61株的家兔全部死亡(5/5),接种FB株的家兔死亡2只(2/5),而接种FBΔgE/gI株的家兔全部(5/5)健活,表明FBΔgE/gI株对新西兰兔的致病力较低,安全性更高。将FBΔgE/gI株分别与水相佐剂GEL02和两性佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊28 d后,采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以PRV变异株FJ-2012攻毒,评估FBΔgE/gI株灭活疫苗对绵羊的保护效力,结果显示,接种GEL02和ISA 206为佐剂的FBΔgE/gI灭活疫苗绵羊在免疫后28 d,抗体均全部转阳;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02作为佐剂的灭活疫苗组绵羊死亡2只(2/5),而以ISA 206为佐剂的绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,表明以ISA 206作为佐剂的FBΔgE/gI株灭活疫苗能够完全保护绵羊抵御PRV变异株的攻击。本研究首次基于PRV自然弱毒FB株构建的FBΔgE/gI株,与Bartha-K61株相比具有更高的安全性,与佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊后能够完全抵抗新发变异PRV的攻击,具有完全保护作用。本研究为我国新发变异PRV疫苗的研发提供了新的参考依据。

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)的gI和gE基因序列 ,自行设计并合成了两对引物 ,对PRV上海株 (PRV_SH)进行PCR扩增 ,产物经琼脂糖电泳分析 ,均呈现一条约 96 0bp和 174 0bp的条带 ,将其克隆入pGEM_T_easy载体中 ,进行了序列测定。将PRV_SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现 ,核苷酸的同源性为 94 .7% ,氨基酸的同源性为91.3% ,证实为gI基因。将PRV_SHgE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较 ,结果显示 ,该序列与PRVEa株、Rice株gE基因的同源性分别为 98.5 %、97.5 % ;推导的氨基酸序列与Ea株 ,Rice株和I型单纯疱疹病毒 (HSV_1) 17株gE的同源性分别为 97.2 %、94 .8%和 15 .6 %。

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK- gE- LacZ+ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK- gE- gI- ORF1-ORF2 + ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK- gE- LacZ+ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。

河南鸡群马立克氏病病毒流行毒株的分子进化分析

为了解鸡马立克氏病病毒流行毒株的分子特征，对2012－2014年河南省发病鸡群的临床病料进行了采集，并对MDV 132 bp重复序列进行了PCR扩增，同时对meq、gE、gI基因进行了克隆和序列测定。结果表明，9份病料中均可扩增出与132 bp双拷贝大小相符的PCR主产物；meq、gE、gI基因的核苷酸序列同源性与国内外参考毒株相比，分别为98．5％～100％，98．8％～100％和98．0％～100％；基于这些基因构建的系统发生树的分析结果表明，与美国、澳大利亚、日本以及印度的MDV分离株相比，目前，河南省鸡群中流行的MDV与此前分离的河南流行株进化关系较近，并且与其他国内分离株共同形成一个较大的独立进化分支。

禽源U6启动子介导鸡马立克氏病病毒gI、gE基因特异siRNA的筛选及干扰活性鉴定

为筛选鸡马立克氏病病毒(MDV)gI、gE基因特异性siRNA,本研究以鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA为模板,扩增禽源cU6-3启动子序列,并合成针对gI和gE基因各5个靶位点的10条shRNA序列。通过重叠PCR将cU6-3启动子与shRNA融合扩增制备shRNA表达盒,将制备的shRNA表达盒分别与重组质粒pEGFP-gI或pEGFP-gE共转染CEF细胞,并根据荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果评价siRNA抑制融合荧光蛋白表达的效率。结果表明,gI和gE基因的抑制效率为10%～80%。分别将其中抑制效率最高的一条shRNA插入pGEM-T载体中构建重组表达质粒pcU6-shgI735和pcU6-shgE936,通过不同细胞系稳定干扰试验和抑制病毒复制试验评价其干扰活性。结果显示,pcU6-shgI735和pcU6-shgE936能够明显抑制融合蛋白的表达及MDV在CEF细胞中的增殖,并且禽源U6启动子构建的表达盒在禽源细胞(DF1)中的活性比在哺乳动物细胞(Vero、MDCK)的活性高1.21～1.45倍。本研究鉴定获得了gI和gE基因的特异性siRNA,筛选出能够抑制MDV复制的靶位点,为MDV基因的功能和抗MDV病毒研究奠定了基础。

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及缺失转移载体的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)的 gI和 gE 基因序列 ,设计两对引物用PCR方法扩增出PRV SH gI和 gE 基因 ,将其克隆入 pUC18载体中 ,获得了缺失部分gI基因的转移载体质粒 ,命名为 pgEI。

新发变异伪狂犬病毒FJ2012株灭活疫苗制备和免疫效力评价

【目的】比较不同种类佐剂制备的伪狂犬病毒(PRV)FJ2012株灭活疫苗的免疫效力。【方法】对PRV新发变异毒株FJ-2012的gE/gI基因采用同源重组技术缺失构建gE/gI基因缺失株(FJ-2012ΔgE/gI株),经甲醛灭活后分别与水相佐剂GEL02、两性佐剂ISA 206VG和白油佐剂制成不同种类的灭活疫苗,经质量检查后免疫绵羊,免疫28 d后采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以变异毒FJ-2012攻毒,评估不同灭活疫苗对绵羊的保护效力。【结果】成功构建了基因缺失株FJ-2012ΔgE/gI,并制备3种不同佐剂的灭活疫苗,接种绵羊后均无不良反应发生。免疫28 d后gB抗体均全部转阳,gE抗体阴性;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02和白油作为佐剂的灭活疫苗组绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,而以ISA 206VG作为佐剂的免疫组绵羊死亡2头,保护率仅为60%(3/5)。【结论】以GEL02佐剂和白油佐剂制成的FJ-2012ΔgE/gI株灭活疫苗免疫绵羊后可以抵御变异毒亲本株FJ-2012株的攻击,能够对我国目前新发变异PRV的防控提供技术保障。

伪狂犬病毒gE、gI和US9三基因缺失株的构建

伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)是一种疱疹病毒,在自然界具有极广泛的宿主类群,是中国养猪业发展主要威胁之一。为了研究病毒的神经传导机制,实验采用Lipofectamine3 000转染试剂,将PP63质粒与伪狂犬病毒Fa株基因组DNA共转染BHK-21细胞,空斑筛选得到gI/gE/US9重组缺失病毒,并命名为SA215-T。采用PCR、基因测序、Western Blot、电镜检查和生长曲线测定等方法检测重组病毒PRV-SA215-T。研究结果显示,Western Blot未发现gE基因的表达,SA215-T株的电镜形态与野毒株无明显差异,SA215-T株与亲本毒株Fa株在细胞中的生长曲线差异不明显且均达到了较高的病毒滴度。

猪伪狂犬病病毒 gE-/gI-/TK-多基因缺失活疫苗对猪的安全性与免疫效力研究

为了研制猪伪狂犬病病毒三基因缺失疫苗,本试验在前期工作的基础上,将TK基因缺失的质粒pBTK与gI-/gE-PRV SA738病毒基因组共转染BHK21细胞,通过蚀斑法进行筛选。用鉴定成功的重组病毒制备活疫苗,分别接种新生仔猪及妊娠母猪,观察仔猪、妊娠母猪产仔数及仔猪健康情况,并进行抗体中和试验和攻毒保护试验。同时与双基因缺失株gI-/gE-/PRV和PRV Bartha k61做对比,以生理盐水做对照。结果成功筛选到重组病毒,命名为gI-/gE-/TK-/PRV SA738,TCID50为5.75~6.125。重组病毒制备的活疫苗,对仔猪和妊娠母猪健康状况均无影响,安全性好,免疫保护率为100%(5/5),有效诱导了机体的保护性免疫应答。结果表明,gI-/gE-/TK-PRV SA738突变株适合作为疫苗毒株使用。

猪伪狂犬病蜂胶疫苗和油佐剂疫苗对小白鼠注射部位损伤的病理组织学比较

用猪伪狂犬病 g E/ g I基因缺失蜂胶灭活疫苗和油佐剂疫苗分别腿肌注射免疫实验动物小白鼠 ,分别于免疫后 2 ,7,1 4 d和 3 5d剖杀 ,取注射部位的肌肉组织 ,常规石蜡包埋切片观察。结果表明 ,蜂胶苗注射后立即吸收 ,局部不留痕迹 ,感官与对照相比无任何差异。免疫 2 d注射局部显微变化轻微 ,7d后肌纤维间隙发现吞噬黄色蜂胶疫苗的细胞 ,1 4 d此种细胞更多 ,3 5d汇聚成片 ;油苗注射后在 3 5d的试验期内一直未能全部吸收。免疫 2 d见肌纤维断裂、肿胀、坏死 ,大量嗜中性粒细胞浸润 ,肌纤维间隙广泛分布油囊 ,7d时局部炎症仍很严重 ,1 4 d表现炎症转归 ,至 3 5d形成肉芽组织包裹的油囊结构。结果表明 ,蜂胶疫苗免疫后 ,不但局部组织学影响明显小于油苗注射组 ,而且可趋化大量吞噬细胞到注射局部 ,促进抗原高效递呈 ,且可在注射局部的吞噬细胞胞浆中停留 3 5d以上 ,可能起到了类似“抗原库”的作用 。

伪狂犬病病毒TK/gI/gE三基因缺失株的构建

为了构建伪狂犬病病毒（PRV）TK/gI/gE三基因缺失重组病毒,试验以PRV-JL14作为母本株,将其基因组与转移载体进行同源重组后,以增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）作为标记基因进行筛选,先后敲除gI、gE和TK基因大部分序列,获得重组病毒PRV-ΔgIgE/TK,并将重组病毒在BHK-21细胞中传代培养并绘制其一步生长曲线,同时以不同剂量对小鼠进行攻毒试验。结果表明：TK、gI和gE基因缺失后的重组病毒基因组稳定,在BHK-21细胞中传代培养20代未见突变;与母本株PRV-JL14相比,PRV-Δg IgE/TK在BHK-21细胞中的增殖能力没有降低,且对小鼠的致病力显著降低。说明试验构建的重组病毒PRV-ΔgIgE/TK可以作为猪伪狂犬病的候选疫苗株。

伪狂犬病病毒gE/gI基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒双基因缺失gI^-/gE^-/PRV SA738灭活疫苗的安全性与免疫效力

在构建gE和gI双基因缺失猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)SA738株的基础上,以绿色荧光蛋白为标志,将gI-/gE-/PRV SA738转染BHK-21细胞,通过蚀斑法得到纯化的gI-/gE-/PRV SA738。毒价检测结果显示,TCID50由7.25下降至5.75,表明该病毒已被弱化,与预期结果相当。将该病毒灭活后,以不同滴度接种无母源抗体仔猪及妊娠母猪,安全性检测表明,gI-/gE-/PRV SA738对仔猪体温、生长,对妊娠母猪产仔及仔猪健康状况均无影响。随后将灭活的gI-/gE-/PRV SA738与弗氏佐剂混合乳化,分别接种家兔与仔猪,免疫后7、14、21、28d采血分离血清。经ELISA检测,家兔免疫后14d、仔猪免疫后7d均显示阳性,对照组均为阴性。抗体中和试验表明,家兔免疫后14d抗体水平比7d显著升高,但至21d,抗体升高不明显;仔猪抗体水平至28d,中和抗体水平达到1∶262.23,与21d相比差异极显著。免疫后28d,采用100LD50PRV强毒攻击动物,进行免疫保护性试验,结果显示,家兔免疫组只有一只出现轻微的一过性临床症状,未出现死亡,而对照组出现了奇痒等较重的临床症状,且于5d后全部死亡;仔猪对照组攻毒后2d,出现了精神高度沉郁、不食、呕吐与腹泻等症状,并于5d后死亡;免疫组攻毒后3d,出现轻微食欲不振、精神萎靡、腹泻等症状,且于攻毒后6d恢复正常,免疫保护率为100%。以上结果表明,该gI-/gE-/PRV SA738-突变株有效诱导了机体的保护性免疫应答。

猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失株rPRV NY-gE^-/gI^-/TK^-的纯化及生物学特性

将猪伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pUC-TKLR与含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的gE/gI/TK三基因缺失PRV变异株rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-/EGFP+基因组经脂质体转染至ST细胞中,进行无荧光重组病毒蚀斑筛选、纯化,并对该病毒在多种细胞上增殖特性、病毒滴度、一步生长曲线和遗传稳定性及其对小鼠的安全性等进行初步研究。结果显示,成功获得重组病毒rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-,不含EGFP。经PCR及测序鉴定,证实获得的rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-在TK基因上缺失311 bp。rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-在ST、PK^-15、VERO和MDCK细胞上的TCID50分别为106.375/0.1 mL,105.625/0.1 mL,105.375/0.1 mL,103.875/0.1 mL;与亲本毒株NY在ST细胞中的毒力(106.5/0.1 mL)相近;当rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-传至20代时,病变细胞仍无绿色荧光,缺失部分TK基因(311 bp),且对小鼠是安全的。

伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株的生物学特性

为了解gE和gI双基因缺失株伪狂犬病病毒gE-/gI-PRV SA738和野毒株PRV-SA的生物学特性,对该病毒进行了理化特性和体外增殖曲线的研究。结果显示:该缺失株对氯仿、酸、热及冻融次数敏感,从双基因缺失毒株与野毒株在BHK-21细胞上的增殖曲线来看,在病毒培养50h之前野毒株的毒价均高于缺失株,而在50h以后缺失株的毒价又高于野毒株,并且在36h时2株病毒的毒价均达到最高峰。