Interaction among Rb/p16, Rb/E2F1 and HDAC1 Proteins in Gallbladder Carcinoma

The mechanism and interaction among Rb/p16, Rb/E2F1 and HDAC1 proteins in gallbladder carcinoma were investigated. By using the immunoprecipitation method, the interactions among Rb, p16, E2F1, HDAC1 proteins in gallbladder carcinoma cell line （Mz-ChA-1） were studied. It was found that there were Rb and E2F1 proteins in the precipitates with anti-HDAC1, and there were HDAC1 and E2F1 proteins in the precipitate with anti-Rb. It was concluded that there are specific interactions among Rb, HDAC1 and E2F1 proteins in gallbladder carcinoma, indicating the existence of the direct Rb/E2F1/HDAC1 signal transduction pathway. There is no direct relationship between p16 proteins with Rb, HDAC1, and E2F1 proteins.

无血清培养胆囊癌GBC-SD细胞形成肿瘤细胞球的鉴定

目的:分离扩增肿瘤干细胞,并鉴定其生物学性质.方法:用无血清培养基培养人胆囊癌GBC-SD细胞得到肿瘤细胞球.将肿瘤细胞球传代扩增,并用含血清培养基培养促使其分化;将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别种入96孔板,MTT检测增殖能力,并将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别植入裸鼠皮下,观察移植瘤的形成;流式细胞术检测CD15s和CD24在肿瘤球细胞和普通GBC-SD细胞中的表达,筛选细胞表面标志物.结果:在无血清培养基中,胆囊癌细胞可以形成少量的肿瘤细胞球,并显示很强的自我更新和增殖能力,含血清环境能够诱导其分化而贴壁生长;在动物实验中,肿瘤球细胞较普通GBC-SD细胞显示更强的致瘤能力(80.00%vs10.00%,P<0.05);标志物CD15s在肿瘤球的表达较普通GBC-SD细胞明显增高(2.56%±0.38%vs10.77%±0.93%,t=18.25,P<0.05).结论:人胆囊癌细胞GBC-SD的肿瘤干细胞可以通过无血清培养环境来分离和扩增,CD15s可能为其细胞表面标志物.

葡萄籽多酚逆转胆囊癌细胞株GBC-SD耐药的研究

目的研究葡萄籽多酚(GSP)逆转先天性耐药细胞株GBC-SD耐药的机制,寻找高效低毒的耐药逆转剂。方法选择先天性耐药细胞株GBC-SD为研究对象。MTT比色法测定各化疗药物的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR测定MDR 1 mRNA的变化;流式细胞仪检测P-gp,bcl-2蛋白和细胞内阿霉素浓度的变化。结果(1)无毒(3μg/mL)和低毒(6μg/mL)浓度的GSP处理后各化疗药物的IC50值均明显下降(P<0.0 5),能明显逆转GBC-SD的多药耐药性;(2)上述两浓度的GSP能下调GBC-SD细胞MDR 1 mRNA表达(P<0.0 5);(3)上述两浓度的GSP能下调GBC-SD细胞P-gp和bcl-2蛋白表达(P<0.0 5);(4)GSP增加GBC-SD细胞内ADM药物浓度(P<0.0 5)。结论GSP能部分逆转先天性耐药细胞株GBC-SD多药耐药性,其作用机制为下调GBC-SD细胞MDR 1 mRNA,及P-gp和bcl-2蛋白表达。

抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱研究

目的研究抗癌活性肽对人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱,筛选与抗癌活性肽作用相关的基因表达改变。方法将1152条人类全长基因的PCR产物按微矩阵排列点样于特殊处理的玻片上制备成表达谱芯片;按一步法抽提抗癌活性肽作用前后体外培养的胆囊癌细胞的RNA并纯化mRNA,通过逆转录用两种荧光Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记对照和实验组胆囊癌细胞cDNA,制成cDNA探针并与表达谱芯片杂交,用ScanArray4000扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,计算机分析判定差异表达的基因。结果在1152条基因中筛选出有差异表达的基因245条,其中上调的121条,下调的124条。结论利用本基因表达谱芯片可同时研究数以千计的基因表达水平,从而在基因水平上探讨抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用的机制。

转染过表达WWOX质粒的胆囊癌细胞株GBC-SD迁移、侵袭能力变化及其机制

目的观察转染过表达WW域的氧化还原酶(WWOX)质粒对胆囊癌细胞株GBC-SD迁移、侵袭能力的变化,并探讨其机制。方法胆囊癌细胞株GBC-SD分为实验组、NEG组、空白对照组,实验组转染WWOX过表达质粒,NEG组转染空载质粒,空白对照组不做处理。采用细胞划痕实验测算各组细胞迁移率,以细胞迁移率表示细胞迁移能力。采用Transwell实验测算各组穿膜细胞数,以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin mRNA,采用Western blotting法检测各组细胞中WWOX、P73、Ecadherin、Vimentin蛋白。结果实验组、NEG组、空白对照组细胞迁移率分别为50.42%±3.47%、74.81%±1.04%、77.82%±2.71%,其中实验组细胞迁移率与NEG组、空白对照组相比,P均<0.05。实验组、NEG组、空白对照组穿膜细胞数分别为(77.33±8.65)、(173.33±6.18)、(187.33±6.94)个,其中实验组穿膜细胞数与NEG组、空白对照组相比,P均<0.05。实验组WWOX、P73、E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量均高于NEG组和空白对照组(P均<0.05),实验组Vimentin mRNA和蛋白相对表达量均低于NEG组和空白对照组(P均<0.05)。结论转染过表达WWOX质粒的GBC-SD细胞株迁移、侵袭能力降低,其机制可能与P73表达上调进而抑制GBC-SD细胞的上皮-间充质转化过程有关。

槲皮素逆转人胆囊癌细胞耐药性的作用机制探讨

目的 探讨槲皮素对先天性多药耐药胆囊癌细胞株GBC-SD多药耐药性（MDR）的逆转情况。方法 分别以10个浓度阿霉素（3.33～33.28μg/ml）及其与不同浓度槲皮素（0.1、0.05、0.025μmol/L）混合液培养GBC-SD,观察细胞生存率及半数抑癌浓度值（IC50）。结果 单用阿霉素培养时IC50为16.65μg/ml,细胞生存率分别为80.58%～26.18%。加用槲皮素培养后IC50分别为6.66、9.99和13.32μg/ml,两两比较,P均〈0.05,且均显著低于单用阿霉素者（P均〈0.05）;细胞生存率均显著低于单用阿霉素者,且逆转能力呈浓度依赖性。结论 槲皮素可逆转GBC-SD的MDR。

CD133蛋白在胆囊癌细胞株及胆囊癌组织中的表达

目的:检测CD133蛋白在胆囊癌细胞株GBC及胆囊癌组织中的表达。方法:用Hoechst染色检测CD133蛋白在胆囊癌细胞株GBC中的表达及分布;用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测CD133蛋白在20例胆囊癌组织和20例正常胆囊组织中的表达。结果:Hoechst染色检测结果显示,CD133主要表达于GBC细胞株的细胞膜和细胞浆中;免疫组织化学检测结果显示,CD133蛋白在胆囊癌组织中高表达,在正常胆囊组织无表达。结论:胆囊癌细胞株及胆囊癌组织中均存在CD133蛋白的表达。

VEGF反义寡核苷酸对胆囊癌细胞VEGF，Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响

目的:体外研究Oligofectamine介导的VEGF反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)转染对人胆囊癌GBC-SD细胞VEGF,Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响.方法:运用Oligofectamine介导的VEGF反义寡核苷酸(ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide,SODN)转染人胆囊癌细胞GBC-SD,半定量RT-PCR检测转染后各组细胞不同时间的VEGF,Flt-1及KDR mRNA表达变化,ELISA测定转染后各组细胞培养上清液VEGF蛋白浓度.结果:半定量RT-PCR发现ASODN组及ASODN+Oligofectamine组24,48,72,96 h VEGF(ASODN组VEGF165:0.686±0.033,0.569±0.049,0.489±0.036,0.716±0.017;ASODN组VEGF121:0.462±0.046,0.338±0.034,0.219±0.022,0.471±0.038;ASODN+Oligofectamine组VEGF165:0.601±0.021,0.465±0.042,0.416±0.023,0.662±0.035:ASODN+Oligofectamine组VEGF121:0.408±0.014,0.286±0.019,0.157±0.021,0.418±0.037)、Flt-1(ASODN组:0.694±0.019,0.562±0.045,0.435±0.042,0.724±0.026;ASODN+Oligofectamine组:0.609±0.018,0.442±0.049,0.314±0.015,0.614±0.029)及KDR(ASODN组:0.667±0.063,0.490±0.033,0.301±0.029,0.665±0.068;ASODN+Oligofectamine组:0.523±0.048,0.432±0.027,0.218±0.036,0.524±0.037) mRNA的表达显著低于Control组(P<0.05),且ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN强(P>0.05).ELISA测定结果显示ASODN组(281.26±18.62,526.44±34.95,791.13±20.99)及ASODN+Oligofectamine组(250.7±14.57,506.09±19.14,711.79±19.91)24,48,72 h VEGF蛋白的分泌浓度均显著低于Control组(394.23±16.26,711.6±26.21,933.85±28.65)(P<0.05),且ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN强(P>0.05).结论:Oligofectamine介导的VEGF ASODN能抑制GBC-SD细胞VEGF,Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌.

17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素对胆囊癌细胞的体外化疗增敏作用

目的:研究17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxy geldanamycin,17-AAG)在体外对胆囊癌细胞的化疗增敏作用。方法:四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度的常用化疗药物和17-AAG对胆囊癌细胞(GBC-SD)生长影响,和低浓度17-AAG对传统药物的化疗增敏作用。结果:细胞毒实验显示17-AAG在体外对胆囊癌细胞有较强的抑制作用。0.1μM和1μM的17-AAG能够增加传统化疗药物对GBC-SD生长的抑制作用,有增效作用。结论:17-AAG可能成为胆囊癌化疗的有效药物及化疗增敏剂。

阿司匹林通过抑制STAT3磷酸化下调MCL-1和VEGF mRNA和蛋白表达促进胆囊癌细胞凋亡、抑制增殖

目的探讨阿司匹林对人胆囊癌细胞株GBC-SD细胞凋亡及增殖的影响及其潜在机制。方法采用MTT法检测不同浓度梯度及作用时间下阿司匹林对GBC-SD细胞增殖的影响,流式细胞术检测阿司匹林对细胞凋亡的影响;Real-time PCR检测GBC-SD细胞中信号转导和转录激活因子3(STAT3)、髓细胞白血病因子-1(MCL-1)、血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达水平,Western blotting检测STAT3、磷酸化信号转导与转录激活因子3(pSTAT3)、MCL-1、VEGF的蛋白表达情况。结果阿司匹林对GBC-SD细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖及时间依赖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。阿司匹林可促进GBC-SD细胞凋亡。阿司匹林可下调MCL-1和VEGF的mRNA表达水平,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),但对STAT3 mRNA表达水平无明显影响(P>0.05)。阿司匹林可下调pSTAT3、MCL-1、VEGF的蛋白表达水平(P<0.05),但对STAT3蛋白表达水平无明显影响(P>0.05);使用STAT3激动剂后,STAT3、pSTAT3、MCL-1、VEGF的蛋白表达水平高于未使用激动剂组(P<0.05),在激动剂组加入阿司匹林后,pSTAT3、MCL-1、VEGF的蛋白表达水平下调(P<0.05),但高于无激动剂组(P<0.05)。结论在GBC-SD细胞中,阿司匹林通过抑制STAT3磷酸化下调MCL-1、VEGF的mRNA及蛋白表达水平,从而促进胆囊癌细胞的凋亡,抑制增殖。

NDRG1基因过表达对胆囊癌GBS-SD细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨N-myc下游调节基因1(NDRG1)过表达对胆囊癌细胞系GBS-SD细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其可能的分子机制,本研究采用脂质体介导的重组真核表达质粒pEGFP-NDRG1-N3瞬时转染人胆囊癌GBS-SD细胞,Western blotting检测NDRG1蛋白的表达;MTT比色法和流式细胞术分别检测细胞增殖和细胞周期;Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力。GBS-SD细胞转染pEGFP-NDRG1-N3重组质粒后经表阿霉素(0.4μg/mL)诱导其凋亡,采用Hoechst33258染色和流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blotingt检测Bcl-2、Cleaved caspase-3和Bid蛋白的表达。MTT检测显示,NDRG1过表达组细胞在48h和72h的增殖速度均显著高于空载组和对照组(p<0.05)。Transwell检测显示,与对照组和空载组相比,NDRG1过表达组细胞的侵袭和迁移能力明显增强。Hoechst33258染色和流式细胞仪检测显示,经表阿霉素诱导细胞凋亡后,空载组细胞的凋亡率最高,NDRG1过表达组细胞的凋亡率低于空载组,但显著高于对照组。Westernblotting检测显示,与对照组和空载组相比,NDRG1过表达组细胞中Bcl-2的表达明显上调,而Cleaved caspase-3和Bid的表达明显下调。本研究表明NDRG1基因过表达可显著促进胆囊癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制其凋亡,其分子机制可能是上调的NDRG1基因能有效调节与细胞凋亡相关基因的表达,从而发挥其介导作用。因此,NDRG1基因可能成为胆囊癌研究中一个新的治疗靶点。

Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株的建立

目的建立Cas9蛋白稳定表达的人肝胆癌细胞株，并验证Cas9的基因编辑活性，以便利用CRISPR/Cas9系统开展肝胆细胞基因编辑的研究。方法在人肝癌细胞（Huh7、PLC/PRF/5、HepG2、Hep3b、SK-HEP-1和Li-7）、人胆管癌细胞（RBE）和人胆囊癌细胞（GBC-SD）中，分别感染Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo、pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro和Cas9m1.1，挑选单细胞克隆培养扩增。提取基因组DNA和总蛋白后，通过基因组聚合酶链反应（PCR）和Western blot验证Cas9的稳定表达。选取其中3个细胞株并感染Lv-EF1α-mCherry，流式细胞术分选出mCherry阳性的细胞，再通过慢病毒感染靶向mCherry基因的向导RNA，细胞扩增后，通过基因组PCR、荧光显微镜下观察和流式细胞术检测mCherry被敲除的情况。结果筛选到100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株，其中表达Cas9-Neo的细胞35株，表达Cas9-Puro的细胞25株，表达突变型Cas9的细胞40株。建立了3株mCherry稳定表达的细胞系Huh7-mCas9-M、PLC/PRF/5-Cas9-M和SK-HEP-1-Cas9-M。基因组PCR和测序显示，同时感染2种gRNA的细胞基因组内存在mCherry片段缺失。荧光显微镜下，同时感染2种gRNA的细胞可以观察到mCherry－EGFP＋细胞。流式细胞仪检测结果显示，mCherry－EGFP＋细胞占0.3%～93.6%。结论成功建立了100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株，其中的Cas9蛋白具有基因编辑活性。