Gap-Repair方式建立一种基于pBR322-Red的新型重组工程系统

应用Gap-Repair新技术,以pBR322为载体,在λ噬菌体Red重组酶的作用下,通过同源重组直接从大肠杆菌DY330染色体上亚克隆了长度为6.7kb的包含Red重组酶基因的λ噬菌体左向操纵子基因序列。建立了一种能够随意在不同细菌宿主中转移的基于pBR32-2Red的重组工程系统。为了验证pBR32-2Red的生物功能,以大肠杆菌染色体上的galk基因为靶标,用Red介导的单链DNA重组技术敲入T→G单碱基突变,使galk基因内编码第145位氨基酸的密码子由TAT转变成TAG,产生了一个琥珀突变。确定了pBR322Red系统的重组功能。

连续三步‘Gap-repair’构建小鼠WAP--人LF杂合基因座

为了构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人乳铁蛋白(hLF)基因组序列在乳腺特异性高效表达的mWAP-hLF杂合基因座,我们采用了连续三步‘Gap-repair’的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的gap-repair技术,第一步从含mWAP基因座的细菌人工染色体(mWAPBAC)上亚克隆了8kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从hLFBAC上亚克隆29kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLF基因组序列;第三步,从mWAPBAC上亚克隆12kb的mWAP基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个全长约49kb的mWAP-hLF杂合基因座。经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hLF基因组序列精确置换的目的。这种连续三步gap-repair构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,将为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。

雌激素对脊髓损伤大鼠运动功能及GAP-43表达的影响

目的探讨雌激素对脊髓损伤(SCI)大鼠运动功能和损伤区域生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的影响。方法72只雄性SD大鼠按随机数表法分为假手术组(A组)、生理盐水模型组(B组)、雌激素组(C组),每组24只,B组、C组制作SCI模型,B组等量生理盐水腹腔注射,C组雌激素腹腔注射。术后3 d、1周、2周、3周检测BBB评分和Rivlin斜板试验。术后3 d、1周、2周、3周时间点处死大鼠取脊髓组织,行免疫组织染色观察GAP-43的表达情况。结果A组大鼠术后3 d、1周、2周、3周BBB评分分别为(20.48±0.57)分、(21.00±00)分、(21.00±00)分、(21.00±00)分,B组分别为(3.18±0.12)分、(4.28±0.15)分、(6.93±0.50)分、(8.95±0.34)分,C组分别为(3.27±0.15)分,(9.67±0.30)分、(14.06±0.69)分、(16.46±0.39)分,术后3 d、1周、2周、3周比较,A组明显高于B组和C组,C组术后1周、2周、3周明显高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05);A组大鼠术后3 d、1周、2周、3周Rivlin斜板试验结果分别为(73.70±1.15)°、(75.00±0.00)°、(75.00±0.00)°、(75.00±0.00)°,B组分别为(22.98±0.98)°、(24.60±0.63)°、(27.58±0.79)°、(30.51±1.18)°,C组分别为(23.77±0.62)°、(29.83±0.66)°、(40.16±0.76)°、(49.00±1.48)°,术后3 d、1周、2周、3周比较,A组明显高于B组和C组,C组术后1周、2周、3周明显高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05);术后3 d、1周、2周、3周,A组大鼠的GAP-43阳性细胞表达数分别为(2.20±0.66)个、(2.28±0.10)个、(2.31±0.17)个、(2.31±0.20)个,B组分别为(15.93±0.59)个、(26.45±0.69)个、(13.61±0.43)个、(4.59±0.47)个,C组分别为(23.38±0.40)个、(31.14±0.86)个、(18.78±0.37)个、(9.87±0.44)个,术后3 d、1周、2周、3周比较,B组和C组明显高于A组,C组明显高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论雌激素能促进脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复,其机制可能是通过增加脊髓损伤区域GAP-43的表达,促进神经的修复和再生。

天津南港工业区路基围埝防护能力提升研究

近年由于受到厄尔尼诺现象的影响,天津港海域风暴潮频发,风暴潮作用对天津南港工业区B03路基围埝及其掩护区域形成较大威胁,因此有必要对其进行安全论证、提高防护能力。本文从修复加固现有结构和改善外部条件两方面提出临时性修复、半永久性加固、封堵合龙口、半封堵合龙口、龙口新建潜堤五种方案,分析阐述了上述各种方案的优缺点。通过技术经济比选,选定了针对本工程最优的半永久性加固方案,研究成果可以在解决实际问题的同时为以后类似工程的设计提供借鉴。

CRTSⅢ型板式无砟轨道层间伤损评定标准

针对CRTSⅢ型板式无砟轨道轨道板与自密实混凝土层间离缝伤损,开展了典型线路无砟轨道现场调研及测量数据统计分析,获取了运营条件下层间离缝分布情况及表观特征,并采用基于高频聚焦超声波反射的无损检测方法对典型区段无砟轨道开展了层间缺陷面积测试。结果表明:CRTSⅢ型板式无砟轨道层间离缝总体程度较轻,发展较慢;离缝长度100 mm以下、宽度1 mm以下、深度50 mm以下的轨道板分别占总数的87.4%、97.8%和96.4%。建议CRTSⅢ型板式无砟轨道层间离缝评定标准按离缝长度、宽度、深度进行两级分类。建议增加缺陷面积比作为伤损评定指标,缺陷面积比5%~10%为Ⅰ级伤损,缺陷面积比大于10%为Ⅱ级伤损。

Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Myostatin基因的敲除

目的:用缺口修复等技术构建Myostatin(肌肉生长抑制素,MSTN)基因打靶载体,并对大白猪胎儿成纤维体细胞进行转染,获得基因敲除细胞。方法与结果:首先构建用于MSTN基因同源长臂(LA)的抓捕载体,然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复,从含大白猪MSTN基因座的细菌人工染色体上亚克隆9.9 kb的LA到抓捕载体上,经过部分序列测定,同源性为100%;通过PCR获得1.4 kb的同源短臂(SA);将LA和SA连入载体pLOXP,构建含有neo和tk正负筛选标记基因的MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN-KO;将线性化的pLOXP-MSTN-KO通过电转染整合到大白猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和丙氧鸟苷进行药物筛选,获得抗性细胞克隆890个,通过PCR和DNA测序鉴定获得基因敲除的细胞克隆4个。结论:构建了有效的MSTN基因打靶载体,通过转染获得基因敲除细胞,为利用体细胞核移植制备MSTN基因敲除猪奠定了基础。

固定义齿修复后食物嵌塞的原因分析及扩隙树脂修复治疗

目的探讨固定义齿修复后食物嵌塞的原因,并对保留固定义齿扩隙树脂修复治疗的效果进行分析。方法选择100例固定义齿修复后出现食物嵌塞的病例,分析食物嵌塞的原因并采取相应的处理方法,对由于与健康邻牙接触不良而导致食物嵌塞者,采用保留固定义齿扩隙树脂修复法进行治疗。结果固定义齿与健康邻牙间接触不良是食物嵌塞的主要原因(70%)。随访3年,100例固定义齿修复后食物嵌塞患者的治疗有效率为100%。结论扩隙树脂修复法是固定义齿与健康邻牙接触不良的一种有效治疗方法。

一种基于最优匹配的低能耗栅栏修复方法

无线传感器栅栏覆盖通常被应用于室外环境,用来监测特定区域。由于传感器自身原因或外界环境影响,栅栏覆盖易被破坏,高效且低能耗的栅栏修复算法尤为重要。本文提出了一种基于最优匹配的低能耗栅栏修复方法(Low-Power Barrier Coverage Repair Method Based on Optimal Match,BCR-OM),该方法首先遍历栅栏搜索栅栏间隙;然后计算完整修复栅栏间隙时,所需要的可移动传感器节点的最小数量;随后利用传感器节点构建栅栏间隙修复路径;最后利用Hungarian算法得出节点的最佳派遣方案,将节点派遣至对应位置,完成栅栏间隙修复。通过仿真实验验证,当栅栏间隙长度为300 m时,本文方法修复栅栏消耗的能量仅为Optimal算法消耗能量的57%,且栅栏修复率比Optimal算法高出近8%,减少能耗的同时有效提高了栅栏修复率。

一种可转移的重组工程系统pYM-Red的建立

重组工程是近几年发展的新型遗传工程技术.以PCR扩增的线性低拷贝质粒pACYCl84为载体,用Gap-repair方法从大肠杆菌DY330染色体上直接体内亚克隆了包括Red重组酶基因在内的长约6.7kb的基因序列,构建了pYM-Red重组质粒.在宿主菌W3110体内进行了染色体上galk基因的敲除,验证了Red重组酶的生物功能,并确定了影响pYM-Red重组效率的诱导时间和线性DNA片段用量.在42℃诱导10 min和线性DNA打靶分子浓度为300 ng时,pYM-Red的重组效率可达到大约每4 000个电转存活细胞中有1个重组阳性克隆,分别比pKD46和pBR322-Red系统高5～6倍.

摆线轮齿形最佳修正方式与修正量的确定方法

通过对修正摆线轮初始间隙的分析与比较 ,提出了一种获得最小初始间隙的正等距 +负移距 +转角的最佳修正方式 ,并对摆线轮修正量的合理选取 。

基于“意愿—行为”缺口修复视角的低碳消费促进策略

通过368份调查数据,在分析城市居民低碳消费意愿与行为现状的基础上,运用二元Logistic回归方法对城市居民低碳消费进行实证分析。结果表明:低碳消费行为与低碳消费意愿两者之间存在较大的缺口;低碳消费意愿受从众心理和生态价值感知的正向影响,却受到年龄的反向影响;低碳消费行为受从众心理的正向影响,却受到年龄和月均收入的反向影响。因此,应着力对低碳消费意愿与行为之间的缺口进行修复;适时打造低碳消费示范区、示范人群,充分发挥低碳消费示范性的辐射作用;加强宣传低碳消费对生态环境的改善作用;着力改变年龄较大城市居民对低碳消费的认知与需求;努力生产更多的低碳型产品,以满足城市居民的购买需求。

自我解释的研究

本文从以下几个方面阐述了关于自我解释的研究 ,首先介绍了自我解释的研究背景 ,然后定义了自我解释 ,并且与其他学习活动进行了比较 ,随后从不同的研究视角揭示出自我解释效果 ,随即讨论了促进自我解释的方法 ,即提示自我解释 ,最后探讨了两种自我解释效果的认知机制

修正摆线轮啮合初始间隙分布规律的研究

介绍了一种求修正摆线轮与标准针轮啮合时初始间隙的简便算法,使计算式中的两个变量φ和τ转变为一个变量τ的函数,大大简化了计算程序。并对等距修正、移距修正、等距加移距修正的初始间隙进行了比较,结论如下:在相同的顶隙要求下,正等距加负移距修正的初始间隙小于等距、移距修正的初始间隙;以及正等距加负移距修正初始间隙最小的条件。

正畸联合修复治疗前牙缺失散在间隙90例临床分析

目的：探讨正畸联合修复技术在前牙缺失散在间隙修复中的临床应用价值。方法：回顾性分析采用正畸联合修复技术治疗的90例前牙缺失散在间隙患者的临床资料。结果：正畸修复均获成功,成功率100%,所有患者均获随访1~2年,随访期间,修复体无松动脱落现象,无炎症倾向,咀嚼功能良好。结论：正畸联合修复技术治疗前牙缺失散在间隙能满足咀嚼功能及美容要求,具有良好的正畸及美容效果,远期效果好,值得推广。

细碎对辊机的特点及若干设计问题分析

通过对国外典型细碎对辊机产品的分析比较,对细碎对辊机产品开发设计中的几个关键问题进行了讨论,并给出了若干建议,可供设计时参考。

柳海矿运输大巷返修工程深部软岩支护设计研究

通过现场调查、室内试验以及理论分析,柳海矿运输大巷支护现状进行分析研究,总结破坏原因。根据现场工程地质条件、岩石特性和破坏特点,确定软岩变形力学机制为高应力膨胀性软岩,并提出采用预留刚隙柔层支护技术进行支护。

一种新的克隆基因方法——重组工程应用研究初报

重组工程(recombineering)是近几年来兴起的一种基于体内同源重组的、新型的遗传工程技术。作为重组工程应用方式之一的空隙修复(gap-repair),是一种捕捉和克隆目的DNA的方法,具有操作简单、步骤少,没有突变、保真度高,不受酶切位点限制等等优点。以pACYC184为模板,PCR扩增含p15A复制子、氯霉素抗性基因和对S.cerevisiaeALD4基因同源臂的线性片段,与酵母染色体DNA共同电击转化诱导型表达了λ噬菌体重组酶活性的大肠杆菌BW25113(pKD46)感受态细胞,通过空隙修复方式,成功地从酵母染色体DNA直接捕捉到大小为1 016bp的ALD4基因部分区段,得到3188bp的重组质粒pACYC184-ALD4。为进一步掌握和充分利用该技术直接捕捉更大片段基因打下了基础。

连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂,构成能进行3次连续基因抓捕的载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术:第一步,从含hACTB基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆10 kb的hACTB基因3′端完整侧翼序列;第二步,从hFⅦBAC上亚克隆13 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)的hFⅦ基因组序列;第三步,从hACTB BAC上亚克隆20kb的hACTB基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成全长约50 kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座达到了原来hACTB基因座中hACTB基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ从起始密码子到终止密码子的基因组序列基因组序列精确置换的目的。结论:连续3步缺口修复构建杂合基因座细胞表达载体的技术,将为细胞高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。

连续3次缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人血清白蛋白杂合基因座

目的:构建人血清白蛋白(hSA)与小鼠乳清酸蛋白(mWAP)调控序列的杂合基因座。方法与结果:在pBR322载体上连入预先无痕连接的3对同源臂,利用基于Red同源重组系统的缺口修复(gap-repair)技术,分别对8kb的mWAP基因座3′调控区、16 kb的hSA基因组编码序列及13 kb的mWAP基因座5′调控区进行连续3次基因抓捕,最终将全长37 kb的乳蛋白杂合基因座构入pBR322载体;通过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,确定mWAP基因座中的编码序列被精确地置换为hSA的基因组编码序列。结论:构建了整合有mWAP-hSA杂合基因座的pBR322载体,为研究杂合基因座在乳腺中的表达效果及置换型基因座表达的可行性提供了数据。

小间隙缝合联合神经碎片对大鼠坐骨神经缺损修复的实验研究

目的:研究神经碎片联合神经外膜小间隙缝合在周围神经损伤修复中的作用。方法:①实验动物随机分为对照组、单纯小间隙缝合组、小间隙缝合+神经碎片组;②术后2周观察神经吻合口大体形态;③术后8周组织观察神经纤维再生情况;④术后8周检测腓肠肌湿重比;⑤病理切片图像分析各组再生神经纤维数目、直径、髓鞘厚度。结果:①术后2周,传统缝合吻合口处黏连,疤痕组织形成;单纯小间隙缝合,无明显粘连。小间隙缝合+神经碎片组,吻合口处无明显粘连,小间隙外膜处变细;②小间隙缝合组与正常对照组相比,湿重比明显增加,小间隙加神经碎片组与小间隙组相比,湿重比明显增加;③小间隙缝合+神经碎片组、单纯小间隙缝合组与对照组相比,有髓神经纤维总数、直径及髓鞘厚度均明显增加,小间隙+神经碎片组神经纤维数、直径及髓鞘厚度与单纯小间隙缝合组相比明显增加。④组织学显示,小间隙加神经碎片组与单纯小间隙组相比,神经纤维密集度增加,排列整齐。结论:神经碎片联合神经外膜小间隙缝合在周围神经损伤修复中具有显著作用。