Primary study on the resistance to bacterial blight(X. oryzae)in Cecropin B gene transgenic rices

Bacterial blight (BB) is one of the major dis-eases to rice. Antibacterial Cecropin B genehas been cloned and transformed into rice. Westudied the resistance to bacterial blight inCecropin B gene transgenic rices.Rice variety JYll9 transformed withCecropin B gene by particle bombardment andprogenies were randomly planted in the field in

人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达

Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 是由Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ的Ｎ 端１１１ 位氨基酸残基和Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｄ 的Ｃ 端１２３７ 位氨基酸残基构成的一个杂合肽，抗菌活性高于天然抗菌肽。根据Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 的氨基酸序列，以酵母偏爱密码设计了Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因，全长１４０ｂｐ 。采用基因片段化学合成结合ＰＣＲ 法合成Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因。合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因克隆到ｐＣＲＴＭ２１ 上，进行ＤＮＡ 序列测定，证实合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因的ＤＮＡ 序列与设计序列完全一致。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因定向克隆到大肠杆菌酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２ 的Ｂａｍ ＨＩ和Ｓａｌ Ⅰ位点上，构建成含Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因的重组质粒ｐＣＡＤ，将重组质粒转化入宿主酵母ＡＢ１０３ ，以大肠杆菌Ｋ１２Ｄ３１ 为指示菌，用活性蛋白酸性ＰＡＧＥ 法测定，具有抑菌活性，表明Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因在酵母中获得表达。

致倦库蚊Cecropin基因克隆及序列分析

目的:克隆致倦库蚊Cecropins基因序列,并进行生物信息学分析。方法:选取致倦库蚊成虫,提取其DNA并以此为模板,设计一对引物,采用PCR技术扩增出Cecropins基因,应用相关生物信息学软件分析其序列。结果:克隆出致倦库蚊Cecropins基因,并测定其扩增产物序列,经同源对比确认,进行了相关序列分析。结论:获得致倦库蚊Cecropins基因序列,基因长度为259bp,与尖音库蚊一致性为97%。

Cecropin B抗菌肽基因的定向诱变与表达

采用寡核苷酸介导的定向点突变法，对天蚕抗菌肽Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ基因１３ 位甲硫氨酸（ Ｍｅｔ） 诱变为亮氨酸（Ｌｅｕ） 或缬氨酸（Ｖａｌ） ，保留１ 位上的Ｍｅｔ，诱变后的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＢＤＮＡ序列分析证明产生了预期的点突变。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ 突变体基因与ｐＧＥＸ４Ｔ２ 融合表达载体中的谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ） 基因融合，在Ｅ．ｃｏｌｉ 中表达，当ＩＰＴＧ 诱导３０ｍｉｎ 后，工程菌的数量开始减少，然后逐渐恢复正常。说明Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ 突变体与ＧＳＴ 基因融合表达后仍然具有很强杀伤原核细胞的作用。

抗菌肽Cecropin B—肿瘤血管生长抑制因子Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。

转CecropinB基因柑桔对溃疡病的离体抗性评价

为评价转抗菌肽基因Cecropin B的锦橙植株对柑桔溃疡病的抗性,分别用喷雾法和针刺法进行了离体叶接种柑桔溃疡病菌试验,并用Real-time PCR和Southern blot进一步分析了Cecropin B在转基因植株中的表达、整合情况。结果显示,与喷雾法相比,针刺接种处理的离体叶片显症时间短,发病率高,便于统计分析。针刺接种6天,大部分转基因植株发病率与非转基因植株无显著差异;其中,PR8、PR11、AAT8和AAT14单株的发病率分别为67.0%、62.9%、68.1%和54.2%,显著低于非转基因植株(96.7%)。对柑桔溃疡病具有抗性的转基因植株(PR8、PR11、AAT8和AAT14)的Cecropin B基因表达量明显高于对照(非转基因植株)。PR8和AAT14植株中的Cecropin B为单拷贝,PR11和AAT8植株中的Cecropin B分别为2个拷贝和3个拷贝。转入Cecropin B可提高锦橙对柑桔溃疡病的抗性。

家蚕和果蝇的抗菌肽cecropin B基因的原核表达及抑菌活性分析

动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的抗菌肽cecropin B基因(CecB2)并克隆至T载体,测序确认后分别克隆至pET-32a载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌进行表达。通过SDS-PAGE和Western blotting检测到2种目的蛋白均得到表达,但表达量存在差异,Bradford法测定纯化后的BmCecB2融合蛋白和DmCecB2融合蛋白的质量浓度分别为0.6、2.0 mg/mL。经Ni-NTA亲和层析纯化和透析处理后的2种产物的抗菌活性存在明显差异:DmCecB2和BmCecB2的质量浓度为10 mg/mL时,对E.coli DH5α的抑菌圈直径分别为15、8 mm左右,最小抑菌浓度分别为0.05、0.10 mg/mL。以上结果说明DmCecbB2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecB2。用生物信息学方法分析家蚕和果蝇的CecB2蛋白在结构上存在差异,这可能是导致2种产物活性不同的主要原因。

用细菌噬菌体T7RNA聚合酶高效表达天蚕蛾菌素(CecropinA)基因

将经聚合酶链反应 (PCR)扩增的 156 bp Cecropin A基因 Ce克隆于载体 p Bluescript(PBS) II KS(+ )上 ,得到重组质粒 p BCe。将该质粒转入 E.coli LE392 .2 3菌株中 ,以含有 T7RNA聚合酶 Gene 1克隆的噬菌体 DE2进行感染表达已克隆的 p BCe基因。提取基因表达产物后进行Western blot分析 ,并进行产物的抗 E.coli JM10 1菌株生长活性试验。结果表明 ,在菌体合成的总蛋白中有 Cecropin A成分存在 ,其含量约占菌体总蛋白的 10 % 。

抗菌肽AD基因的合成

设计并合成了一种新型抗菌肽基因，合成的抗菌肽（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）ＡＤ基因全长１４０个碱基对，克隆于ｐＣＲＴＭ２１载体上，经ＤＮＡ序列分析证实，合成的ｃｅｃｒｏｐｉｎＡＤ基因的碱基序列与设计序列完全一致．

几丁质酶和抗菌肽D双价基因转化茄子的研究

在建立茄子的组织培养及遗传转化体系的基础上，以根癌农杆菌为介导，采用叶盘法将几丁质酶和抗菌肽Ｄ双价基因转入茄子，分别获得６株ＫａｎＲ植株。对ＫａｎＲ植株进行点杂交、ＰＣＲ扩增等分子检测。结果表明，目的基因已整合进茄子核基因组中。

新型抗菌肽基因设计、合成及其在酵母中的表达(Ⅰ)——杂合抗菌肽基因的设计与合成

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础，选用酵母高频使用密码子设计了一种新型抗菌肽基因，基因合成采用二次ＰＣＲ（聚合酶链式扩增）方法．设计和合成的基因全长１４０个碱基对，包括氨基酸编码序列、起始密码子、终止密码子和两端限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ识别顺序，合成的基因克隆于ＰＣＲＴＭ２．１载体上．经ＤＮＡ序列分析证实，合成基因碱基序列与设计序列完全一致．

抗菌肽基因导入桑树获得抗病转基因植株

用携带抗菌肽基因的农杆菌处理桑子叶，在含有羧苄青霉素（Cb）400～500mg／L和卡那霉素（Km）20mg／L的MS培养基上，有32.4％的子叶产生了不定芽；66.5％的不定芽在含有Cb300mg／L和Km30～40mg／L的培养基中,正常生长成2～3cm高的新稍；新梢在含Cb50mg／L和Km10mg／L的生根培养基中有72．6％形成完整根系。3次转化共获得12个株系55株KmR植株。不同株系桑苗叶片DNA点杂交分析显示，7个株系有阳性杂交信号。KmR株系桑苗的抗病性测定显示，5个株系共14株桑苗对青枯病具有较强抗性.

天蚕素抗菌肽的性质、功能及应用研究进展

天蚕素(Cecropin)是发现的第1个动物抗菌肽,具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、寄生虫等多种生物活性。文章总结了天蚕素抗菌肽的性质、结构,重点综述了天蚕素基因工程重组表达系统、表达策略,生物活性及应用现状等研究,并对相关研究发展趋势进行了展望。

转抗菌肽基因辣椒株系的青枯病抗性鉴定及系统选育

利用通过农杆菌介导技术获得的T0代转抗菌肽基因辣椒植株为试材,对其自交株系世代群体连续进行抗青枯病鉴定筛选、分子生物学检测和系统选育,首次获得了具有抗青枯病能力的转抗菌肽基因辣椒稳定株系。同时,对其主要果实性状、青枯病抗性进行的对比试验结果表明,转抗菌肽辣椒株系除抗青枯病能力明显提高外,果实性状基本不变。上述结果显示,外源目的基因主要特性的遗传是稳定的、表达是忠实的,从实践上验证了转抗菌肽基因工程操作的实用性。

抗菌肽D基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的 将抗菌肽D基因克隆至甲醇营养型酵母表达载体pPICZα A中 ,并与α factor信号肽相连接 ,经EcoRⅠ酶切分析和PCR扩增鉴定 ,获得阳性重组子。方法 用锂盐法将重组表达载体转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)受体菌GS115 ,筛选获得阳性克隆。结果 将阳性菌落发酵产物进行抑菌试验 ,表达产物有较强的杀菌作用 ,表达产物杀菌活性达到5 6 5 6U ml。结论 抗菌肽D基因已经导入酵母细胞并整合在其基因组中 ,表达产物均具有高效的杀菌作用 ,有希望开发成为一种新型的抗菌消毒药物。

农杆菌法将抗菌肽D基因导入蕉柑胚性细胞的研究

用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽D基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞 .再生芽经PCR、Southern杂交证明抗菌肽D基因已整合到其基因组DNA中 .在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中 ,共培养介质中的乙酰丁香酮 (As)能显著提高其转化效率 ,与对照相比 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从 0提高到 0 .75 .悬浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响 ,共培养 1、2、3d后 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数分别为 0 .2 0、0 75、0 .

天蚕素AD和蛙Buforin Ⅱ融合蛋白在大肠杆菌中的表达

本试验采用改良二步全基因合成法人工合成了含大肠杆菌偏爱密码子的天蚕素AD和蛙BuforinⅡ成熟片段的融合基因,并克隆至pMD18-T中,经测序确认正确后,与pET-Trx连接,构建了表达载体pET-Trx-CAD-BuforinⅡ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。表达产物占菌体总蛋白的35%,经羟胺裂解后对测试菌具有较好的杀菌效果,为进一步的开发与应用打下了基础。

中国家蚕抗菌肽CMIV基因的合成与克隆

根据从中国家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）蛹中提取的抗菌肽ＣＭＩＶ的氨基酸序列，设计兼顾大肠杆菌和昆虫两种不同体系偏爱密码子的ＣＭＩＶ基因序列；用固相合成法合成６段寡聚核苷酸，通过二步电泳法快速纯化之，复性，连接并克隆到ｐＵＣ９中，转化大肠杆菌ＪＭ１０９；在Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、ＡｍｐＬＢ平板上挑选白色克隆，用限制性酶谱法筛选含有合适插入片断的质粒ＤＮＡ；然后通过序列分析得到了含有与设计完全一致的ＣＭＩＶ基因序列的阳性克隆。

转抗菌肽B基因水稻植株的获得与鉴定

构建了一个适合在水稻中表达含有抗菌肽Ｂ基因的转化载体（ｐＣＢ１），应用基因枪转化法将其导入水稻未成熟胚，获得了一些转基因水稻植株。根据对选择标记基因和目的基因的分子检测和抗病性测定，证明抗菌肽Ｂ基因已整合入转化水稻基因组并在转基因水稻中表达了抗病性。