产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变

目的 克隆产气荚膜梭菌 β2 毒素基因 ,并选择可能影响其生物活性的氨基酸的相关碱基位点进行定点突变 ,构建β2 毒素基因的突变体。方法 利用PCR从C型产气荚膜梭菌基因组DNA中 ,扩增出约 0 7kb的基因 ,将其克隆至pGEM T载体上。经GOLDKEY软件分析抗原表位 ,PCR定点突变技术进行 2 34位半胱氨酸→苷氨酸的定点突变。结果 β2 毒素基因核苷酸序列与报道的一致 ,其突变基因 6 99位核苷酸由T→G。结论 已成功克隆了 β2 毒素基因 ,并准确实施了预期定点突变。

牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gB、gC、gD基因的分子克隆与序列分析

对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)内蒙古分离株gB、gC、gD基因进行克隆和序列测定,结果表明IBRV内蒙古分离株gB、gC、gD基因序列分别为2 850、1 723、1 559bp,编码933、508、417个氨基酸组成的完整开放阅读框。序列比较和系统进化树分析结果显示:内蒙古分离株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的相似性为94.9%～99.9%,其推导的氨基酸相似性在90.3%～99.7%,不同IBRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。在系统进化树中内蒙古分离株与瑞典毒株亲缘关系较近,属于同一个分支。

香樟Actin基因的克隆及表达分析

Actin作为一个看家基因,经常在实时定量PCR中被用作内参对不同样品中的m RNA进行定量,因此在基因表达分析中扮演重要的角色。利用同源克隆的方法,根据Gen Bank中已经公布的其他植物的Actin基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)技术从香樟中获得了4个c DNA片段。分子生物学分析软件分析结果显示,4个片段大小为均为998 bp,编码332个氨基酸;同源性分析表明,所获得的片段属于Actin亚家族,分别命名为Cc ACTa、Cc ACTb、Cc ACTc和Cc ACTd并提交Gen Bank(登录号:KM086736、KM086737、KM086738和KM086739)。实时定量PCR结果显示,Cc ACTc在根、茎、叶及低温处理的叶片中表达量相对稳定,可以作为候选内参基因。

NY-ESO-1基因在人食管癌中的表达及其基因克隆

背景与目的:NY-ESO-1是从食管癌cDNA文库中筛选到的肿瘤抗原,但是该基因在食管癌组织中的表达情况尚未见报道。本文研究NY-ESO-1基因在食管癌中的表达率,以便于确定食管癌患者是否可以使用以NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法:采用RT-PCR方法检测了NY-ESO-1基因在30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达;采用分子克隆的方法从食管癌组织中克隆了NY-ESO-1cDNA。结果:NY-ESO-1基因在食管癌组织中的表达率为50%(15/30),在30例相应癌旁正常组织中未见表达;克隆的NY-ESO-1cDNA序列与GenBank报道一致。结论:NY-ESO-1基因在食管癌中高频率表达,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-I类分子限制性CTL识别。

小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因腺相关病毒载体的构建

目的:构建小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的腺相关病毒载体。方法:利用RT-PCR方法,从Balb/C小鼠脾细胞的mRNA中扩增T-bet基因全长cDNA,经测序证实后插入Pzac2.1质粒,用磷酸钙沉淀法,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,并通过抽提病毒DNA进行PCR扩增鉴定重组病毒的形成,设立eGFP基因为对照。结果:1592bp的小鼠T-bet基因被成功克隆,分析表明,与Genbank中发表的序列相比具有99.8%的同源性。重组质粒Pzac2.1-T-bet的PCR及酶切鉴定表明T-bet基因被定向插入,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞包装成病毒后,经荧光显微镜和病毒DNA的PCR检测,证实已完成对重组病毒的包装。结论:成功构建了小鼠T-bet基因的腺相关病毒载体rAAV-T-bet,为免疫紊乱性疾病的T-bet基因干预治疗奠定了基础。

鸡球虫重组疫苗的研究进展

球虫病是由艾美耳球虫引起的一种对家禽危害极为严重的全球性寄生虫病 ,目前仍以药物防治为主。由于球虫抗药株的不断出现、研制新药的费用昂贵和药物残留的日趋严重 ,使得球虫疫苗研究成为近年的热点。采用DNA重组技术获得的重组疫苗逐渐受到人们的重视 ,发展很快。综述近年来家禽球虫重组疫苗的研究情况 ,探讨重组疫苗的利用前景、存在问题和解决途径。

桑树花青素合成相关基因MaLAR和MaUGAT的克隆与表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)是催化无色花青素转化为儿茶素的一个关键酶,是植物类黄酮生物合成路径中的一个下游酶,可抑制无色花青素在花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的催化下转化为花青素;花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷⁃2⁃O⁃葡萄糖醛酸转移酶(cyanidin⁃3⁃O⁃glucoside 2⁃O⁃glucuronosyltransferase,UGAT)是植物花青素生物合成路径中一个关键酶,其催化花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷转化为花青素3⁃O⁃(2⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸基)⁃β⁃D⁃葡萄糖苷,使得无色花青素最终转化为稳定的花色苷物质而累积在果实中。通过与川桑(Morus notabilis)基因组数据库进行比对鉴定到了MaLAR和MaUGAT基因,并以粤椹大10与和田白桑的桑椹cDNA为模板克隆了MaLAR和MaUGAT基因。聚类分析结果表明粤椹大10 MaLAR与甜樱桃(Prunus avium)亲缘关系较近,和田白桑MaLAR与川桑亲缘关系较近;粤椹大10 MaUGAT与和田白桑MaUGAT均与川桑亲缘关系较近,均属于蔷薇目。实时荧光定量PCR检测表明MaLAR在和田白桑桑椹S1—S3阶段的表达水平均高于粤椹大10;而MaUGAT则在粤椹大10桑椹S2—S3阶段中表达水平显著高于和田白桑。研究表明MaLAR在桑树花青素合成途径中可能起负调控作用,而MaUGAT在桑树花青素合成途径中可能起正调控作用。

针刺对胃扩张模型大鼠孤束核c-fos表达及胃内压的影响

目的观察针刺内关、足三里等穴对胃扩张模型大鼠孤束核c-fos表达及胃内压的影响,阐明NTS可能是内关、足三里穴共同调节胃功能的一个重要的延髓初级中枢。方法采用抗FOS蛋白的免疫组织化学技术和电生理技术。结果(1)造成大鼠胃扩张模型后,NTS内c-fos的表达增加,而电针足三里、内关穴组与胃扩张模型组比较,NTS内FOS阳性细胞数均有显著性降低(P<0.01);电针足三里穴、内关穴组NTS内FOS阳性细胞数显著低于电针偏历穴、合阳穴组(P<0.01)。(2)电针足三里穴、内关穴组能显著升高胃扩张模型大鼠胃内压(P<0.01),其胃内压升高程度高于电针偏历穴、合阳穴组(P<0.01)。结论NTS是针刺内关、足三里穴共同调节胃功能的整合中枢之一;经穴对脏腑的调控具有相对的特异性。

家蚕细胞周期蛋白E(Cyc E)基因的2种剪切体克隆及其蛋白质的亚细胞定位

细胞周期蛋白E(Cyc E)是细胞从G1期转换到S期的重要调节因子。为了解家蚕Cyc E的功能,从家蚕BmN细胞中克隆了2种不同剪切方式的cyc E片段,分别命名为cyc E1173和cyc E837(GenBank登录号:HQ619696.1,HQ619697.1),将2种剪切体分别融合eGFP后利用杆状病毒系统在BmN和Sf9细胞中进行表达产物的亚细胞定位实验。家蚕cyc E的2种剪切方式的变化主要集中在第5～6外显子处。Cyc E1173和Cyc E837在2种细胞系中都定位于细胞核,但在Sf9细胞中存在Cyc E1173的荧光逐渐聚集到核膜及核心荧光弱化的现象,而在BmN细胞中,Cyc E1173和Cyc E837的荧光分布均匀,这种差异的原因可能与Cyc E出核降解相关。Western blotting检测在Sf9细胞中表达的Cyc E1173出现2条降解条带,而Cyc E837的融合蛋白并无这种降解情况,其可能的原因是cyc E1173和cyc E837之间存在表达产物降解水平上的差异,Cyc E1173更容易降解,推测其与细胞周期调控的关系更为密切。

家蚕N-乙酰基转移酶基因BmNAT的克隆与表达分析

N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase,NAT)是昆虫体内一种催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶,主要与色素沉积、生理节律等有关。对已公布的家蚕(Bombyx mori)N-乙酰基转移酶基因Bm NAT(Gen Bank登录号:NP_001040401.1)进行生物信息学分析:该基因序列全长763 bp,ORF为564 bp,编码187个氨基酸残基,分子质量21.4 k D;多序列比对表明Bm NAT与脐橙螟(Amyelois transitella)同源蛋白质的序列相似性最高。通过原核表达的方法制备了融合Bm NAT蛋白,经蛋白质纯化并免疫新西兰兔获得多克隆抗体。亚细胞定位显示Bm NAT主要存在于细胞质和细胞核中。利用Western blotting检测Bm NAT在家蚕不同发育时期和5龄幼虫各组织器官的表达谱,结果表明Bm NAT在蛾、卵期以及5龄幼虫的头部表达量较高,与Bm NAT的qRT-PCR检测结果基本一致,初步推断Bm NAT可能在家蚕的这些组织或发育时期发挥一定的生物学功能。流式细胞实验显示Bm NAT对细胞周期可能存在一定的影响。

单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达

单环刺螠(Urechis unicinctus)纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化得到的一组有抗凝和纤溶活性及较好生物安全性的纤溶酶。本研究为获得重组表达的UFE,根据该纤溶酶Ⅲ的(UFEⅢ)N端测序结果,设计简并引物,扩增出该蛋白的部分基因编码序列,利用5′-RACE PCR获得(UFEⅢ)的cDNA全长序列863bp,其中开放阅读框编码261个氨基酸。通过生物信息学分析其为丝氨酸蛋白酶家族成员,并与之前实验室提取的UFEⅢ进行同源性分析,推测其为一组同工酶。以PMD18-T-UFE为模板,扩增单环刺螠纤溶酶的成熟肽片段,构建重组表达载体pET32a-UFE和pET28a-UFE,转入Rosetta2(DE3)菌中诱导表达,UFEⅢ分别以可溶蛋白和包涵体的形式得到了表达。

黑鲷×真鲷杂交子代与真鲷的Calmodulin基因克隆与表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得的黑鲷(Acanthopagrus schlegelii,♂)×真鲷(Pagrus major,♀)的杂交子代F_1(AP)与真鲷(Pm)的两组Calmodulin(CaM)基因序列。通过生物软件分析了两者的差异及所表达的蛋白质特性;同时,应用实时荧光定量PCR技术检测了APCaM与PmCaM在仔鱼及2龄鱼的6种不同组织中的表达特征。结果表明:1)克隆得到APCaM与PmCaM的cDNA全长分别为1 230 bp、1 210bp,两基因序列均具有一个450 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码了一个由149个氨基酸组成的多肽,该多肽包含有高度保守的4个EF-hand功能结构域。杂交F_1与真鲷的CaM基因非翻译区差异位点主要在3'端,ORF区域有5个氨基酸差异。2)两基因与其它鱼类的核苷酸序列相似性最高为95%,与氨基酸序列相似性最高为100%;从基因序列结构及蛋白质属性表明APCaM与PmCaM属保守的CaM基因家族。3)定量分析表明CaM在检测组织中均有表达,其中APCaM在脑中表达量最高,PmCaM在性腺中表达最高;APCaM与PmCaM在脑、肌肉、性腺及鳃中的表达存在显著差异(P<0.01),在肝、肾组织及仔鱼中的表达无显著差异(P>0.05);结合杂交F_1与双亲本在生长及性腺发育上的性状,推测CaM可能与生长及性腺发育调控有关。这些结果为探讨CaM基因在杂交F_1及真鲷亲本中的作用及鲷科育种研究提供基础资料。

肠膜明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp dextrani-cum)基因组DNA中扩增出了葡聚糖蔗糖酶基因dsrD并将其连接到表达载体pET-30(a),得到重组质粒pET-30-dsrD,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的170kD特异蛋白条带出现。经测定酶活力达1.2U/mL,约是原始菌株的30倍。

萝卜抗菌肽基因AFP的克隆及其在大肠杆菌中的诱导表达

试验采用RT-PCR方法,从萝卜叶子中克隆得到抗菌肽基因AFP(antifungal protein)。该基因全长240个碱基,79个氨基酸。经测序证明克隆所得基因与GeneBank中发表的原序列一致。将此抗菌肽基因克隆到E. coli表达载体pET28a,在IPTG的诱导下表达出含有AFP的11.99 ODD,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达。

辣椒雄性不育系葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

为了深入研究辣椒雄性不育与能量代谢之间的关系,该研究以辣椒近缘物种番茄的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(G6PDH)同源序列为基础,采用电子克隆的方法克隆出辣椒CaG6PDH基因。利用荧光定量PCR技术,对辣椒雄性不育系9704A与其保持系9704B花蕾发育的不同阶段,以及保持系9704B不同组织(茎、叶、花、果皮、胎座、种子)中CaG6PDH基因进行表达分析。结果表明:两系中获得的CaG6PDH基因的编码序列一致,全长1 533bp,编码510个氨基酸残基;辣椒CaG6PDH基因在保持系不同组织中表达量存在差异,胎座中表达量最高,茎中表达量最低;辣椒CaG6PDH基因的表达量在花蕾发育的不同阶段雄性不育系均高于保持系,此种差异在小孢子发育的单核期与成熟期尤为明显,这种差异可能使雄性不育系能量代谢供应出现异常,从而影响小孢子的正常发育而导致雄性败育。

柔嫩艾美耳球虫基因在丝状体蓝藻中的克隆

以纯化的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊为模板 ,根据已知的序列设计一对引物 ,用RT PCR方法扩增出球虫的SO7基因 ,通过三亲接合转移、新霉素筛选、序列分析等方法得到了转球虫基因工程蓝藻。这为球虫基因在蓝藻中表达奠定了基础。

巴西橡胶树水解酶基因克隆与表达分析

磷是植物生长发育所需的大量重要元素,而缺磷是提高橡胶产量的重要限制因子,研究橡胶树耐低磷胁迫的分子机制,对提高橡胶树磷养分的利用效率具有重要意义。利用低磷胁迫差减文库获得的EST,通过RT-PCR和RACE技术克隆橡胶树应答低磷胁迫基因,并利用实时荧光定量PCR技术进行表达分析。结果表明,从橡胶树中克隆到1个应答低磷胁迫的水解酶基因HbHyd,全长1860bp,包含1个1479bp的完整阅读编码框(ORF),编码56.1kD(492aa)蛋白,经NCBI同源性分析,HbHyd编码的氨基酸序列与蓖麻水解酶的氨基酸序列一致性为84%。利用荧光定量PCR分析HbHyd的表达水平,可知在低磷磷胁迫处理下,HbHyd在橡胶树根中表达量明显上调。HbHyd基因在橡胶树应答低磷胁迫过程中上调表达,该基因的克隆有助于提高橡胶树磷素吸收利用效率。

大麦抗白粉病基因分子标记应用研究进展

培育抗病品种是防治大麦白粉病最经济、安全的有效措施,抗病基因的鉴定和利用是大麦抗病育种的先决条件。随着分子生物学技术的不断发展,分子标记已成为抗病基因鉴定、定位和克隆的必要手段,大麦抗白粉病"分子设计育种"将逐步成为现实。目前,12个专化性主效抗白粉病基因已经通过分子标记定位在1H、2H、4H、5H和7H染色体上。此外,还在所有的染色体上发现多个抗白粉病QTLs(Quantitative trait loci)位点。已克隆7个主效大麦抗白粉病基因,分别为mlo、Mla1、Mla6、Mla7、Mla10、Mla12和Mla13。

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因片段在真核表达载体中的亚克隆

目的将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体 pBKCMV中,以便对其进行核酸疫苗的研究。方法特定寡核苷酸引物的设计和合成,TRIZOL 提取日本血吸虫成虫 RNA,RT-PCR 法扩增 GST 基因编码序列,将扩增产物连接 pGEM-T 克隆载体,再亚克隆到真核表达载体 pBK CMV 中。结果 RT-PCR 法特异性扩增出 SiGST 编码基因片段,其大小约为670bp,经双酶切、PCR 鉴定表明所构建的质粒 pGEM-T-GST 和 pBK CMV-GST中含有目的基因。结论 pBK CMN-GST 重组质粒的成功构建,为进一步表达 GST 及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。

南京椴HMGR基因的克隆和功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)是植物萜类代谢中甲羟戊酸途径的关键酶,本研究运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,首次从珍稀植物南京椴中克隆出HMGR的全长基因TmiHMGR,其长度为2160 bp,包含一个1758 bp的开放阅读框,其推导蛋白TmiHMGR编码585个氨基酸残基,相对分子量为62.9 kD,pI为6.11。将TmiHMGR与其他植物HMGR氨基酸序列构建进化树,结果显示Tmi-HMGR与苹果的HMGR聚为一枝。采用半定量RT-PCR分析TmiHMGR在根、茎和叶中的表达情况,结果表明该基因在茎中的表达量最高,根和叶中的表达量相对较弱。验证功能的颜色互补实验结果显示,TmiHMGR能够使代谢流明显朝类胡萝卜素合成的方向进行,说明TmiHMGR在萜类产物生物合成中是一个重要因子。