摩腹联合电针透穴法对失眠大鼠生物钟相关基因及神经递质表达的影响

目的探讨摩腹联合电针透穴法对失眠大鼠生物钟基因Clock、BMAL1、PER1表达及神经递质乙酰胆碱(ACh)、谷氨酸(Glu)含量的影响及可能的作用机制。方法50只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、摩腹组、电针透穴组和联合组,每组10只。除正常组外,采用腹腔注射对氯苯丙氨酸建立失眠大鼠模型。摩腹组进行腹部按摩,电针透穴组采用平刺法,百会透神庭、三阴交透阴陵泉(双侧)、神门透内关(双侧),电针仪疏密波,频率1Hz/20Hz,联合组摩腹后进行电针透穴治疗,各组均1次/d,连续7d,正常组和模型组不予干预。HE染色观察下丘脑组织神经元细胞形态变化,RT-qPCR检测下丘脑组织Clock、BMAL1、PER1 mRNA表达,免疫组化染色检测下丘脑组织Clock、BMAL1、PER1表达,Western blot检测下丘脑组织Clock、BMAL1、PER1蛋白表达,ELISA检测血清ACh、Glu含量。结果与正常组比较,模型组大鼠入睡潜伏期延长,睡眠持续时间缩短,下丘脑组织细胞结构破坏严重、呈空泡样变化,神经元细胞数量减少,下丘脑组织Clock、BMAL1mRNA和蛋白表达升高,PER1mRNA和蛋白表达降低,血清ACh、Glu含量增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,摩腹组、电针透穴组和联合组均能缩短入睡潜伏期,延长睡眠持续时间,改善下丘脑神经元细胞形态,降低下丘脑组织Clock、BMAL1mRNA和蛋白表达,上调PER1mRNA和蛋白表达,减少血清ACh、Glu含量,差异均有统计学意义(P<0.05),以联合组作用最显著(P<0.05)。结论摩腹联合电针透穴法能改善大鼠失眠状况,其机制可能与调控生物钟基因Clock、BMAL1、PER1mRNA和蛋白表达及神经递质含量有关。

鸟枪法筛选枯草芽孢杆菌基因强启动子及对黄牛GHRL基因的表达

利用鸟枪法通过大肠埃希菌-枯草芽孢杆菌启动子探针载体分离到枯草芽孢杆菌168菌株的103个基因启动子片段,发现1个672 bp的启动子片段P3.4.23,能够在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌高效启动报告基因β-半乳糖苷酶的表达,其酶活性分别达到3 418、2 877 U/mL.相似性分析表明P3.4.23启动子片段具有枯草芽孢杆菌基因启动子的保守序列,并确定其转录活性区域位于5～333 bp,为yxiE基因的调控序列.将黄牛GHRL基因导入到启动子亚克隆序列下游,使该基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达.

强力霉素诱导表达脑啡肽细胞株的构建及其对慢性神经痛大鼠的镇痛作用

目的构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株,并评价鞘内移植该细胞对慢性坐骨神经压榨性损伤(CCI)大鼠的镇痛效应。方法应用逆转录病毒转染法,建立受强力霉素调控表达人前脑啡肽原基因(hPPE)的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/Tet-On/hPPE),实时定量PCR及放射免疫分析法检测强力霉素对该细胞株脑啡肽表达的定量调节。将IAST/Tet-On/hPPE细胞植入CCI大鼠蛛网膜下腔,观察腹腔注射强力霉素对其镇痛效应的影响及免疫组织化学检测脊髓背角Fos蛋白的表达。结果实时定量PCR及放射免疫分析结果显示,强力霉素可定量调控IAST/Tet-On/hPPE细胞株中脑啡肽的表达;IAST/Tet-On/hPPE植入CCI大鼠的蛛网膜下腔后,大鼠机械缩爪阈值升高(P<0.05),脊髓背角浅层Fos蛋白表达明显降低(P<0.05),且该镇痛效应受强力霉素调控。结论成功构建了可调控的定量表达脑啡肽的永生化星形胶质细胞株,其有望成为慢性疼痛治疗的新方法。

大鼠糖尿病早期给光/撤光中心视网膜神经节细胞分层的变化

目的探讨大鼠糖尿病早期给光/撤光中心视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)分层的变化规律,以解释糖尿病早期对比敏感度下降的原因。方法采用基因枪技术标记大鼠糖尿病早期RGC,以带Z轴的Leica显微镜和CCD照相机对标记的RGC进行拍照,并获得不同物像在纵轴的深度读数,分析树突层面在内丛状层的位置。结果①糖尿病第1个月和3个月时的撤光中心RGC的树突分层位置向内核层靠近,与正常大鼠相比差异有显著性(P<0.001)。糖尿病第1个月和糖尿病第3个月时的给光中心RGC的树突分层位置与对照组相比差异均无显著性(P>0.05)。②从分布上看,撤光中心RGC的树突分层向0%方向单向移动,这种变化主要出现在B类(糖尿病第1个月时P<0.001,糖尿病第3个月时P<0.01)和C类细胞(糖尿病第3个月时P<0.001)中。给光中心RGC的树突分层比例与正常组相似,仅在糖尿病第1个月时A类细胞树突分层位置向内核层有所移位(P<0.01)。③在糖尿病第1个月和第3个月时分别发现85个和119个的异常RGC细胞。结论糖尿病第1个月和第3个月时RGC细胞树突在内丛状层的分布受到了干扰,可能导致明暗刺激在视网膜上的不平衡,引起对比敏感度的下降。

五种常用的植物转基因技术

从原理、基本步骤和优缺点等几个方面对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍。

基于投影寻踪法的某火炮选型研究

火炮选型是某装备论证的重点工作之一,论证时采取了选型评价指标定量对比、指标间综合分析的方法。但该方法缺乏对备选火炮定量评价数据的充分挖掘,不能反应评价数据特征。为提高火炮选型的准确性和客观性,采用投影寻踪法进行定量分类评价。通过分析火炮选型原则及装机适应性和火力性能要求,建立了由选型原则、选型评价指标、指标特征值分层的火炮选型评价指标体系,形成了由备选火炮选型指标特征值为样本集的评价模型;采用制约函数法构建投影指标优化模型,为避免初值和初始搜索方向引起的局部收敛问题,用多种群遗传算法求解;模型求解获得了最佳投影方向及投影值,得到了各备选火炮的选型定量评价排序以及评价指标权重。排序结果与论证时定性分析对比结果较为相符,且权重较高的评价指标与论证时确定的重点指标一致,验证了投影寻踪法可用于类似武器选型问题。

重组质粒在洋葱表皮细胞的转化

采用基因枪法，将SCaM4-Citrine、PepA-mRFP和ECBP21-mRFP3种融合蛋白基因转化到洋葱内表皮细胞．同时，将SCaM4-Citrine、PepA-mRFP基因以及SCaM4-Citrine、ECBP21-mRFP基因分别等量混合，共转化入洋葱内表皮细胞，23℃光照培养18～22h，利用激光共聚焦显微镜可观察到大量融合蛋白的表达，基因枪转化技术获得成功．并发现，对于洋葱表皮细胞来说，幼嫩部分的细胞转化率比老的高，并且枪击压力为7580kPa或9300kPa时为最适压力．

EntransterTM纳米载体介导大鼠角膜CD25siRNA转染的效果及安全性评估

背景 基因转染是多种眼病基因治疗的有效方法,理想的非病毒载体是研究角膜基因治疗的关键因素,选择高转染率、基因高表达、低毒性的非病毒载体是成功实施基因治疗的前提. 目的 探讨EntransterTM、脂质体非病毒载体对正常SD大鼠角膜转染CD25 siRNA的转染率和安全性,筛选角膜基因转染的最佳载体.方法 应用随机数字表法将80只雄性SPF级成年SD大鼠随机分为EntransterTM-CD25 siRNA 组、脂质体-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,每组20只,均以右眼作为实验眼.实验眼眼表麻醉后刮除角膜上皮,按照分组不同分别用EntransterTM-CD25 siRNA、脂质体-CD25 siRNA、单纯CD25siRNA和生理盐水各50μl点眼.于点眼后12h、24 h、3d和7d在裂隙灯显微镜下观察大鼠眼表组织反应,检查各组大鼠角膜表面绿色荧光个数.分别于上述时间点处死各组大鼠各4只并获取角膜组织,采用苏木精-伊红染色法行角膜组织病理学检查;采用罗丹明染色行荧光检测,评估各组大鼠角膜基因转染的转染率;采用TUNEL染色法检测实验眼角膜细胞的凋亡情况以评估各种转染载体的安全性;采用免疫荧光技术检测角膜组织中CD11b的表达. 结果 EntransterTM-CD25 siRNA组大鼠角膜表面的荧光染色数量及强度明显高于脂质体-CD25 siRNA组,单纯CD25 siRNA组大鼠角膜荧光染色出现早,但转染后24 h角膜荧光染色消失.角膜组织病理学检查显示,各组大鼠行基因转染后脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜上皮水肿和角膜炎性细胞浸润程度较EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组严重,角膜基质层和内皮层未发现异常,脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜炎性细胞数明显多于EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,差异均有统计学意义（均P=0.00）.TUNEL检测发现,基因转染后12h和3d,脂质体-CD25siRNA组大鼠角膜细胞凋亡数明显多于EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,差异均有统计学意义（均P=0.00）.免疫荧光检测显示,CD11b荧光主要分布于角膜上皮层和角膜基质层,随着基因转染后时间的延长,脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜组织中CD11b的表达量逐渐增加,基因转染后24 h时荧光强度达峰,随后逐渐减弱,至转染后第7天仍可见弱荧光.EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25siRNA组和生理盐水组大鼠角膜组织中均未发现CD11b的荧光表达. 结论 EntransterTM纳米材料作为载体转染CD25 siRNA于正常SD大鼠角膜具有转染效率高、毒性低、不引起角膜免疫反应的特点,可作为角膜疾病基因治疗的合适载体.

高分辨率熔解曲线检测大肠癌KRAS基因突变

目的研究高分辨率熔解曲线(HR M)检测大肠癌KR AS突变的准确性及敏感性。方法采用HR M检测大肠癌KR AS基因外显子2和3突变情况并与直接测序比较,研究HR M准确性。用KR AS野生型样本系列稀释KR AS外显子2第12个密码子突变型(0,1%,5%,10%,15%),采用HR M检测,评价其灵敏度。结果81例大肠癌肿瘤组织石蜡标本,检测到11例KR AS外显子2突变(13.58%),外显子3无突变。162例正常组织标本未检测到突变。HRM检测与测序结果一致率100%。HRM可检测到1%KRAS外显子2第12个密码子突变型。结论 HRM可以准确定性的检测KRAS基因突变分型,灵敏度达1%。

17β-雌二醇对培养的乳鼠心肌细胞肥大的影响

目的观测17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)对肾上腺素(PE)诱导的乳鼠心肌细胞肥大的影响并探讨其机制。方法以培养的乳鼠心肌细胞为模型并分组给药,用计算机图像分析软件测量心肌细胞表面积,[3H]标记亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率,免疫细胞化学方法检测心肌细胞原癌基因c-fos蛋白表达,半定量RT-PCR检测心肌细胞肥大特征性胚胎型基因β-肌球蛋白重链(β-MHC)、α-骨骼肌肌动蛋白(α-skA)和心房肽(ANP)的mRNA表达。结果17β-雌二醇明显抑制肾上腺素诱导的心肌细胞表面积和蛋白质合成速率的增加;17β-雌二醇减弱肥大心肌细胞c-fos蛋白表达;17β-雌二醇降低β-MHC、α-skA的mRNA表达,但增加ANP mRNA表达。结论17β-雌二醇可抑制心肌细胞肥大,其作用机制可能与抑制原癌基因c-fos的蛋白表达,逆转收缩蛋白基因(β-MHC和α-skA)向胚胎型转化及促进ANP mRNA表达有关。

海洛因对雌性大鼠催乳素基因表达的影响

目的:研究海洛因对雌性大鼠垂体催乳素(PRL)基因表达的影响。方法:50只雌性Wistar大鼠,随机分为5组(每组10只):对照组、海洛因给药3和9 d组、海洛因给药9 d后停药3和9 d组;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测垂体PRL mRNA相对含量,放射免疫分析法(RIA)检测血浆催乳素(PRL)水平。结果:给药3和9 d组及停药3 d组大鼠垂体PRL mRNA水平显著低于对照组(P<0.01),停药9 d组PRL mRNA的水平虽低于对照组,但差异无显著性(P>0.05);与给药9 d组相比,停药3 d组PRL mRNA水平有增高趋势,但差异无显著性(P>0.05),停药9 d组的PRL mRNA的水平则显著高于给药9 d组(P<0.05)。给药3和9 d组及停药3和9 d组血浆PRL显著低于对照组(P<0.01);与给药9 d组比较,停药3 d组的血浆PRL水平仍然较低(P<0.05),停药9 d组的PRL水平有高于给药9 d组的趋势,但差异无显著性(P>0.05)。结论:海洛因使雌性大鼠垂体PRL mRNA表达水平下降,短期停用海洛因其无法恢复到正常水平。

理脾调脂胶囊对血脂失调症大鼠及ApoE基因敲除小鼠PPARs mRNA的调控作用

目的研究理脾调脂胶囊对血脂失调症大鼠及ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠PPARα、γmRNA的调控作用,探讨其调节脂质代谢的作用机制。方法 48只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、理脾调脂胶囊治疗组(理脾调脂组)、血脂康对照组(血脂康组),造模4周,将ApoE-/-小鼠30只随机分为空白组、血脂康组、理脾调脂组。理脾调脂组大鼠、ApoE-/-小鼠(以下简称大、小鼠)每日灌胃理脾调脂胶囊,血脂康组每日灌胃血脂康,用药8周。酶法测定大、小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)浓度,沉淀法测定大、小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C);内参照模板法荧光定量PCR检测大、小鼠肝脏PPARα、γmRNA的表达。结果理脾调脂组大、小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度较模型组、空白组显著降低(P<0.01),HDL-C浓度显著提高(P<0.01),大、小鼠PPARα、γmRNA表达较模型组(或空白组)显著提高(P<0.01);与血脂康组比较,理脾调脂组大、小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度均降低(P<0.05),HDL-C浓度均显著提高(P<0.01,P<0.05),PPARα、γmRNA表达明显提高(P<0.05)。结论理脾调脂胶囊能显著提高实验性血脂失调症大、小鼠肝脏PPARα、γmRNA的表达,具有调控核因子而影响血脂代谢的作用。

棕色棉茎尖基因枪遗传转化

为了建立高效的棉花茎尖遗传转化体系,以棕色棉品种新彩棉5号为材料,采用茎尖培养和基因枪遗传转化方法,通过对凝固剂种类、活性炭含量、卡那霉素浓度、渗透处理时间、轰击压力、轰击距离等因素的优化,建立了棕色棉新彩棉5号茎尖基因枪遗传转化技术体系。结果表明,不同凝固剂种类、活性炭含量、卡那霉素浓度、渗透处理时间、轰击压力和轰击距离对棕色棉茎尖转化率有明显影响。最佳的遗传转化体系为:前渗处理4 h,轰击压力7.586 MPa(1100 psi),轰击距离9 cm,轰击后恢复培养4 d,然后在MSB+8 g·L^(-1)琼脂+125mg·L^(-1)卡那霉素筛选培养基中筛选25 d。获得抗性芽后,在添加1 g·L^(-1)活性炭的生根培养基中诱导抗性芽生根,并获得抗性再生植株。通过PCR和q PCR检测,5200个茎尖共获得16株阳性转基因植株,转化率为0.31%。该技术体系的建立为棕色棉的遗传转化奠定了基础,为彩色棉育种提供了新的材料。

建立同类提取法从基因芯片检测数据中挖掘大鼠肝细胞的肝再生关键基因

为解析基因芯片检测数据的生物学意义,用Rat Genome 230 2.0芯片检测大鼠肝再生中肝细胞的基因表达丰度,用F检验大鼠2/3肝切除组(PH)与假手术组(SO)的基因表达差异性和获得大鼠肝细胞的肝再生相关基因,用同类提取法从过滤法计算的差异基因中筛选特征基因,根据特征基因的关联度、参与的生理活动和他人研究结果确认其中的关键基因.结果表明,Ccne1、Egf、Met等57个特征基因在大鼠肝再生中起关键作用.

同类提取法结合序列向前法预测大鼠肝再生的关键基因

从生物高通量检测数据中挖掘关键基因/蛋白是生物信息学的重要研究内容.用大鼠基因组表达谱芯片Rat Genome 230 2.0检测大鼠肝再生中肝细胞的基因表达丰度和计算它们与对照的比值(ratio值),用F检验发现,Ccne1、Eg f、Met等8419个基因与大鼠肝再生相关.用过滤法从中筛选出3202个差异基因,用同类提取法从差异基因筛选出1000个特征基因.取前100个特征基因作为初选基因,进一步用序列向前法计算发现,Ccnd1、Grin2a、Spsb4等7个基因满足肝再生候选关键基因的条件.再用同类提取法分析发现,上述7个基因中,Ccnd1和Agtr1的关联度≥100,且文献报道与肝再生相关,当属关键基因.用机器学习法检验关键基因的正确性发现,同类提取法结合序列向前法预测的关键基因正确率达97%以上.因此,用该方法预测关键基因切实可行,值得推广应用.

Structures of nucleolus and transcription sites of rRNA genes in rat liver cells

We observed the ultrastructure of nucleolus in rat liver cells by conventional electron microscopy, and employed cytochemistry NAMA-Ur DNA specific stain method to analyze the distribution and position of nucleolar DNA in situ. The results showed that nucleolar DNA of rat liver cells comes from nucleolus-associated chromatin, and continuously extends in the dense fibrillar component (DFC) of nucleolus, localizes at the periphery of fibrillar center (FC) and in DFC. Furthermore, by employing anti-DNA/RNA hybrid antibodies, we directly and selectively labeled transcription sites of rRNA genes and testified that localization of transcription sites not only to DFC but also to the periphery of FC.

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS（v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）基因突变的方法。方法采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测，以评价其灵敏度。应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况，并与直接测序法的结果进行比较分析。结果HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可获得检测结果。HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10％的突变，其检测灵敏度达10％。HRM法从60份大肠癌患者组织标本中，检出17份KRAS基因密码子12或13突变（28．3％）；直接测序法检出15份（25．0％）突变，2份未检出KRAS基因突变。HRM法检测的敏感度为100％（15／15），特异度为96％（43／45）。结论HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时，具有操作简便、快速、灵敏，单管避免污染等优点，完全符合临床个体化治疗的要求，值得推广。

益气养阴活血法对糖尿病大鼠肾脏Nrf2基因表达的影响

目的观察具有益气养阴活血作用的丹蛭降糖胶囊(DJC)对糖尿病大鼠肾脏Nrf2的影响。方法取雄性SD大鼠50只,随机选出9只为正常对照组,予基础饲料喂养,其余给予高脂饲料,4周后一次性腹腔注射STZ 35mg/kg造模,尾部取血,以血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。将成模的大鼠分为模型对照组、DJC高、低剂量组、吡格列酮组,连续8周灌胃给药。取血清测定大鼠FBG、HbA1c、TG、TC;取出肾脏,PCR法测定肾组织Nrf2表达。结果 DJC高、低剂量组Nrf2的表达量显著增高,与模型组比较差异显著(<0.01)。与正常组比较,模型组FBG、HbA1c、TG、TC明显升高(<0.01),用药后各药物组上述指标显著下降(<0.01或<0.05)。相关分析显示Nrf2与糖化血红蛋白密切相关。结论具益气养阴活血作用的DJC能够提高糖尿病大鼠肾脏Nrf2的高表达,能够降低血糖、血脂、糖化血红蛋白。