副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌（H1~H9）,并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,表明该基因在分离菌株中得到了相应的表达。这将为副猪嗜血杆菌致病菌株毒力特征基因的鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究奠定基础。

副猪嗜血杆菌hhdB-A基因的鉴定和分析

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1～H9),并对其hhdB-A基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB-A基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdA基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165,HPS59的hhdA基因同源性为98%～100%,分离菌株hhdA基因之间序列同源性为99.0%～99.9%;hhdB基因序列与SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hhdB基因之间序列同源性为97.5%～99.8%;推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB-A基因的目的条带,表明该基因在分离菌株中得到了相应的表达。

副猪嗜血杆菌分离株hhdA和hhdB基因的克隆及同源性分析

用预先设计好的hhdA和hhdB基因的PCR扩增引物,扩增不同血清型的副猪嗜血杆菌分离株中的hhdA和hhdB基因,将扩增产物与克隆载体pMDTM18-T连接,转化入感受态细胞DH5α,通过PCR、双酶切及序列测定,测序结果表明:扩增的16株HPS菌中有11株能扩增出hhdA基因,其中10株有测序结果,该10株菌的hhdA基因全基因序列有7种长度,分别为1 754、1 755、1 758、1 759、1 760、1 761和1 762bp。另外,16株HPS菌中有9株能扩增出hhdB基因,该9株菌的hhdB基因全基因序列有7种长度,分别为1 628、1 637、1 639、1 640、1 641、1 646和1 647bp。对于相同血清型的不同菌株来说,它们的2段目的基因序列长度两两不一致。强毒株中,71%的菌株均能扩增出hhdA和hhdB基因;中毒型菌株也基本可以扩增出hhdA和hhdB基因;而无毒型菌株均没有扩增出目的基因。同源性比对可知:所分离菌株的hhdA之间和hhdB基因之间,以及它们分别与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdA和hhdB基因之间序列同源性都在98%以上,说明所分离的菌株中均含有hhdA和hhdB基因序列。同源系统进化树分析可知,hhdA和hhdB基因在分离菌菌株间具有良好的保守性,可作为研制HPS新型疫苗的候选基因。