斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建

adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员,主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域,与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先,通过分析软件筛选出该基因的敲除位点,利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA),再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收,将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中,得到F0代嵌合体。随后,对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测,结果表明,注射的胚胎出现了碱基缺失的现象,即sgRNA有效,将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选adgrf3a突变杂合子,并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序,建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后,adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交,获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现,adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异,然而,体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。

革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用

目的构建1个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性。方法构建的载体主要包括以下成分:π蛋白依赖性复制起点oriR6K;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ;反向选择标志SacB;正向选择标志卡那霉素抗性片段。载体构建完成后,采用该载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行框架内敲除,以验证其有效性。结果成功构建了敲除载体,命名为pYG4,并对yeeZ基因进行了框架内精确敲除获得突变株。结论本研究构建的载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的精确敲除,将在细菌基因功能研究中得到广泛的应用。

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat^r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat^r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。

变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。

BALB/c鼠口服免疫猪水肿病大肠杆菌基因突变菌株的免疫效果

为了研究猪水肿病(ED)大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用已构建的猪ED大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株口服免疫BALB/c小鼠,检测其血清中的IgG抗体及粪便和肠黏液中的sIgA抗体水平,并进行淋巴细胞增殖检测及攻毒保护实验。结果表明该基因突变菌株具有良好的免疫性,能诱导小鼠体内产生IgG和sIgA抗体,并且能引起T淋巴细胞增殖反应。攻毒保护实验结果显示,口服免疫突变菌株能对小鼠提供良好的保护,保护率为75%(15/20)。本研究结果证明,该大肠杆菌基因突变菌株在小鼠体内能激发体液免疫和细胞免疫反应,可作为猪ED口服疫苗的候选菌株。

胸膜肺炎放线杆菌relA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为探究信号分子4或5磷酸鸟苷[(p)ppGpp]对胸膜肺炎放线杆菌(APP)适应性及致病性影响,本研究以APP血清7型S8为亲本株,通过同源重组、卡那抗性及蔗糖负向筛选的方法,将(p)ppGpp的合成调控基因relA敲除,构建缺失突变株S8△relA。生物学特性鉴定结果表明,S8△relA具有良好的遗传稳定性,与亲本株增殖速度变化差异不显著,但平台期营养限制环境下,S8△relA存活能力降低,而且在Gly、Ile、Val营养缺失时,S8△rel生长能力显著抑制;S8△relA的持留菌形成能力、生物膜形成能力以及体外抗肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬能力均有不同程度降低;对小鼠致病性试验结果显示,S8△relA相比亲本株S8毒力降低2.7倍。研究结果表明(p)ppGpp在环境胁迫下参与APP适应性调控,并对其毒力有一定的影响。本研究首次证明了(p)ppGpp作为一种信号分子,同样可以调控APP的生长,并且在宿主肺部弱营养环境条件下,APP与致病力相关的表型均受到影响,这为进一步阐明APP的致病机制提供实验依据。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC^-/ GFP^+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统 ,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG ,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化 ,它的突变apxIICA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB0 3染色体上野生型apxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了apxII基因突变株HBC- GFP+ ,PCR和Southernblot对突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。

人Elongator复合物Elp4亚基基因可部分补偿酵母ELP4缺失菌株的生长缺陷

为研究人Elongator复合物Elp4亚基的功能 ,将人ELP4基因转入酵母ELP4基因缺失的突变菌株 (elp4△菌株 )中 ,并对转化菌株进行功能互补实验和SSA3和PHO5基因表达分析 ,结果表明人的ELP4基因不能恢复突变菌株对高盐的敏感性 ,但可以在一定程度上缓解突变菌株对高温、咖啡因 (Caffeine)和 6 氮尿嘧啶 (6 AU)的敏感性 ,部分恢复低磷条件下PHO5基因表达延迟的缺陷 ,并可在热激条件下提高SSA3基因的表达 ,因此人的ELP4基因可以部分补偿酵母ELP4基因缺失所引起的生长缺陷 ,提示人的Elp4亚基可能与酵母的该亚基功能相似。

膦甲酸钠联合干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎的临床疗效

目的 :比较膦甲酸钠与干扰素联用和单用干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效。方法 :选择慢性乙型肝炎患者 6 1例 ,分为联合组 2 3例和干扰素组 38例 ;联合组用膦甲酸钠 4.8g静滴 ,qd ,疗程 1月 ,合并用干扰素α 1b30 0万u ,im ,隔日 1次 ,疗程 3个月。干扰素组单用干扰素。以谷丙转氨酶 (ALT)、乙肝病毒标志物 (HBVM )、乙肝病毒DNA及前C区基因野生株和变异株为观察指标 ,比较不同治疗方案对指标的影响。结果 :治疗 3个月后联合组与干扰素组对慢性乙肝患者血清HBeAg/抗 HBe转换率分别为 47.8%和 2 8.9% (P >0 .0 5 ) ;对慢性乙肝患者血清HBV DNA的阴转率分别为 6 9.5 %和 34.2 % (P <0 .0 1) ;对慢性乙肝患者HBV前C区基因野生株与变异株总阴转率分别为 6 9.6 %和 36 .8% (P <0 .0 5 )。联合组对慢性乙肝患者的ALT的复常率及HBsAg滴度的降低均强于干扰素组。结论 :膦甲酸钠与干扰素联用有协同作用 ,其抗病毒疗效均优于单用干扰素组。

单增李斯特菌inlB基因缺失株的构建及其生物学特性

为探究单增李斯特菌inlB基因缺失株的生物学特性,利用同源重组技术成功构建了inlB基因突变株(LM90-△inlB)。对突变株进行了溶血试验、细菌计数小鼠肝、脾和脑载菌试验测定、体外耐酸碱生长培养试验及鼠脑微血管内皮细胞侵袭、黏附、增殖试验。结果显示,突变株溶血活性无变化;小鼠肝脏载菌量突变株低于亲本株,但差异不显著,脾脏载菌量无差异;突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株有明显升高(P<0.05);在体外耐酸碱生长能力培养中,inlB突变株耐酸性没有改变,而耐碱能力强于亲本株;细胞黏附侵袭及增殖试验表明突变株明显低于亲本株(P<0.05)。说明inlB基因对LM90的毒力具有一定的调控作用,结果对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了科学依据。

InlA／InlB基因的双缺失对单增李斯特菌毒力的影响

为了探讨InlA/InlB对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力的影响,本研究利用同源重组技术在LM△InlA菌株的基础上构建LMInlA/InlB基因双缺失株。通过小白鼠肝脾脑细菌计数、LD50和溶血实验,研究LM在InlA/InlB基因缺失后毒力上的差异。结果显示:LM△InlA/△InlB基因双缺失株与LM菌株相比,双缺失株的LD50升高2个数量级;与LM△InlA、LM△InlB菌株相比,双缺失株的LD50均升高1个数量级;双缺失菌株在小白鼠肝脏、脾脏和脑组织内的载菌量均显著减少(P<0.05);但没有改变其溶血特性。结果提示,InlA/InlB基因双缺失后,LM菌株的毒力能够明显减弱,但不改变其溶血特性。

组蛋白不同乙酰化位点突变对酵母细胞生长和Ssa3、Gal1基因表达的影响

组蛋白乙酰化对基因表达和细胞生长非常重要.为揭示组蛋白H3K14和H4K8的乙酰化修饰对不同条件下细胞生长和Ssa3、Gal1基因表达的重要性及二者功能差异.构建了H3K14、H4K8分别突变为精氨酸的单突变株S14、S8及二者同时突变的双突变株D814,并对其在正常、高温、咖啡因存在等条件下生长及Ssa3、Gal1表达进行比较.结果表明,所有突变株对咖啡因敏感性增加;D814对温度敏感,且在供试条件下其生长及Ssa3和Gal1激活均明显慢于野生型和单突变株;除半乳糖和葡萄糖为单一碳源,30℃时两单突变株差别不大外,其它条件下S8生长及Ssa3和Gal1激活均慢于S14.表明H3K14、H4K8乙酰化对细胞生长和适应不利环境非常重要,而且在对不利条件的快速适应方面,H4K8的乙酰化修饰可能更为重要.组蛋白突变株的表型缺陷是因该条件下细胞生存所必需的基因激活延迟所致.

LuxS基因缺失对变形链球菌耐酸性的影响

目的:探讨变形链球菌Ingbritt C(血清C型)国际标准株与LuxS基因缺失的变形链球菌突变株之间耐酸能力的差异。方法:配制相同浓度的变形链球菌标准株与LuxS缺陷株菌悬液,分别在不同pH值(pH3.5～7.0)的BHI液体培养基中培养相同时间后,用紫外分光光度计测定吸光度,比较2种菌株的生长情况;先在轻度酸性环境(pH5.5)中预酸化,再将2种菌株于致死性pH值环境(pH3.0)中培养,比较其适应性耐酸能力。结果:①pH值为6.0～7.0时,2种菌珠在相同pH值条件下生长情况间的差异无显著性(P>0.05),且3组不同pH值条件下细菌生长情况间的差异亦无显著性(P>0.05);②pH值为4.5～5.5时,2种菌株的生长情况的差异有显著性(P<0.05);③在pH值为3.0时,LuxS缺陷株的生存率(0.006 5%)要明显低于标准株的生存率(0.078%),差异有显著性(P<0.05)。④在pH值5.5环境下预酸化后,LuxS缺陷株的生存率(0.747%)约为标准株生存率(8.65%)的1/10。结论:在亚致死性pH值中,变形链球菌标准株与LuxS缺陷株的耐酸能力具有差异,标准株的耐酸能力强于LuxS缺陷株,2种菌株均表现出了适应性耐酸的能力;变形链球菌LuxS缺陷株对酸的敏感性增加,而适应性耐酸能力仍然存在。

角膜混浊小鼠突变候选基因Map3k1克隆与序列分析

对具有角膜混浊表型的B6-Co突变系小鼠突变候选基因Map3k1进行克隆及测序分析,寻找该突变系小鼠Map3k1基因的突变位点。以小鼠Map3k1基因的mRNA、全长及上游5 kb序列设计引物,分别以基因组DNA和mRNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术分段扩增目的基因,将目的片段连接在T载体上,转化至感受态细胞,筛选阳性克隆,质粒DNA分子提取,电泳检测,EcoRⅠ酶切释放目的片段,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。成功扩增出Map3k1基因的20个外显子和上游调控序列,B6-Co小鼠测序结果与基因组数据库序列比对,该基因位于13号染色体第112 559 574的碱基由T突变为A,编码的蛋白质第314氨基酸由亮氨酸变为谷氨酸,但是该基因的表达调控及蛋白质剪切机制仍有待深入研究。

LuxS基因缺失对变异链球菌生物学性状的影响

目的:观察LuxS基因突变对变异链球菌生物性状的影响。方法:将变链菌标准株和LuxS突变株分别培养于TSA、TSA-Cmr、BHI培养基培养48 h,通过菌落形态观察、常规生化检测、革兰染色涂片观察和生长曲线,比较两种菌株的生长特性;体外建立LuxS基因突变株和标准株的生物被膜模型,结晶紫染色,观察比较两菌株形成生物被膜的能力。结果:在含氯霉素的TSA-Cmr固体培养基中增塑,标准株基本不能生长,而突变株的生长状况基本正常。在不含氯霉素的TSA固体培养基中培养,两种菌株的菌落形态没有明显差别,革兰染色镜下观察,可见标准株菌体呈长链状排列且相互缠绕,而突变株菌体多呈短链状排列,形成长链的较少。生长曲线观察发现:两菌株在生长模式上基本一致,均呈典型的"S"型曲线,只是在进入生长的稳定期后,两者在细菌饱和度上有一定差异,即11.5～22.5 h之间各时间点标准株的A值均明显高于LuxS突变株(P<0.05)。在BHI培养基中两菌株均能形成生物被膜,但结构存在差异:标准株形成光滑且均匀分布的生物被膜,而突变株的生物被膜形态较粗糙。结论:LuxS基因突变对变异链球菌的生长以及生物被膜形成能力等生物学性状有一定影响。

双元载体提供组蛋白H3/H4拷贝1的elp3Δ菌株的构建

人Elongator是在转录中有功能的组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物,为研究其催化亚基Elp3功能,构建了酵母组蛋白H3/H4拷贝1的双元表达载体pRS316CFT,通过PCR介导的基因敲除,获酵母基因组H3/H4缺失由双元载体提供单拷贝H3/H4的elp3Δ菌株.敏感性实验表明该载体提供H3/H4可维持酵母正常生长.本工作为构建H3/H4乙酰化位点突变菌株,用功能互补在体内研究人Elp3 HAT活性功能奠定了基础.

变异链球菌LuxS基因突变株生物被膜结构的电镜观察

目的:探讨变异链球菌IngbrittC(血清C型)国际标准株与LuxS基因缺失的变异链球菌突变株之间生物被膜的形成差异。方法:分别将变异链球菌标准株和LuxS基因突变株接种于含有2%葡萄糖、2%蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中,以牙釉质磨片为载体,于扫描电镜下观察形成24h的上述两菌株生物被膜。结果:(1)当以葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌标准株和LuxS基因突变株所形成的生物被膜表现型未见明显差异;(2)当以蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物被膜有明显的不同,标准株生物被膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株的生物被膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落;(3)加入标准株的无菌体上清液可以使LuxS基因突变株的生物被膜表型部分恢复正常,提高LuxS基因突变株形成生物被膜的能力。结论:变异链球菌标准株和LuxS基因突变株均能形成生物被膜,但LuxS基因突变株的生物被膜结构发生改变;依赖于LuxS的群体感应系统会影响变异链球菌生物被膜的形成。

念珠菌类细菌样变异株基因特征初步研究

目的在对念珠菌发生变异后其形态、结构等生物学性状研究的基础上,进一步探讨念珠菌类细菌样变异株基因特征。方法在低温、营养缺乏条件下诱导白色念珠菌标准菌株使其变异;用不同浓度梯度的氟康唑等临床常用抗真菌药物诱导白色念珠菌标准菌株变异。采用煮沸法制备真菌基因模板,采用细菌保守基因16SRNA序列引物和真菌保守基因18SRNA序列引物分别扩增16SRNA和18SRNA序列,琼脂糖凝胶电泳,观察并记录结果。同时将细菌保守基因16S RNA扩增片段进行测序,所得序列进行BLAST比对分析。结果念珠菌类细菌样变异株16SRNA序列均扩增阳性,而白色念珠菌标准株未出现相应的扩增条带。念珠菌类细菌样变异株18SRNA序列扩增除2号菌株有微弱的条带外,其余变异株均未扩增出目的条带,而白色念珠菌标准株则出现相应的扩增条带,表明念珠菌类细菌样变异株基因组中18S RNA序列所占比例不多或是因多次传代遗失。念珠菌类细菌样变异株16SRNA扩增片段经纯化后进行DNA序列测定,BLAST进行比对分析,发现念珠菌类细菌样变异株序列与数据库中细菌序列有较高的相似性。结论念珠菌类细菌样变异株基因组含有细菌保守基因及少量真菌保守基因,具有原核生物学性状的念珠菌类细菌样变异株是源于真核生物的念珠菌。此研究在生物进化特别是在原核细胞与真核细胞的进化联系上有非常重要的意义。

LuxS基因缺失对变形链球菌蛋白表达的影响

目的通过双向电泳技术对比研究变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白质的表达差异,为进一步研究LuxS信号系统对变形链球菌致龋毒力的调控机制奠定基础。方法提取变形链球菌标准株及LuxS突变株的菌体总蛋白质,采用双向电泳技术对比研究两者蛋白质的表达差异,找出差异蛋白点。结果与标准株菌体总蛋白2-DE图谱相比较,LuxS突变株菌体总蛋白2-DE图谱中有61个斑点的蛋白质表达量发生了改变:36个点蛋白质表达量升高,25个点蛋白质表达量降低。结论变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白存在明显的差异,表现为2-DE图谱蛋白斑点染色的深浅不同,提示LuxS突变株菌体总蛋白发生了量的变化。

断奶仔猪对毒力基因缺失大肠杆菌的免疫应答

为研究猪水肿病大肠杆菌SLT-Ⅱe编码基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用构建的突变菌株(O139/SLT-Ⅱe*/07)口服免疫断奶仔猪后,检测突变菌株在仔猪肠道的定植情况,仔猪血清及粪便中的特异性抗体和细胞因子水平,并进行了免疫保护效力评价。结果显示,免疫后21 d仍能在实验1组(微胶囊口服免疫)和2组(直接口服免疫)的仔猪粪便中检出突变菌株;从免疫后第7 d、14 d和21 d开始,在实验1组血清样品中可分别检测到抗SLT-ⅡeA蛋白、F18ab菌毛蛋白和O139抗原的IgG抗体(P/N>2);从免疫后第7 d、14 d开始,在粪便中可分别检测到抗SLT-ⅡeA蛋白、SLT-ⅡeB蛋白、O139抗原、F18ab菌毛蛋白的sIgA抗体(P/N>2);免疫仔猪血清中的INF-γ的含量升高;实验2组的血清特异性IgG水平和粪便中sIgA抗体水平比实验1组低;该突变菌株对仔猪具有免疫保护作用。研究结果表明该大肠杆菌基因突变株可作为仔猪水肿病口服疫苗的候选菌株。