萜类生物合成的基因操作

萜类是一组结构迥异的化合物家族,其中很多具有较大的应用价值,如青蒿素和紫杉醇等,它们在多种微生物和植物中合成,但其天然产量低。萜类代谢工程通过DNA重组技术改造萜类合成细胞中的代谢途径,以提高萜类最终产量或在不含萜类的生物中合成萜类,为促进有用萜类合成提供了新的机会。以萜类化合物生物合成途径的基因转移与表达为切入点,综述了目前在微生物及植物中应用代谢工程提高萜类产量的研究进展。

马铃薯优化转化系统的建立

本试验研究了用根癌土壤杆菌转化马铃薯的各种条件，在采用品种东农３０３的材料和Ａ２０８、Ａ２８１两种野生型根癌土壤杆菌的研究中筛选出了各个优化转化条件，建立了优化遗传转化系统．其结果为①外植体：块茎；②根癌土壤杆菌浓度：５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ；③ｐＨ值（共培养）：５．８；④共培养中加入乙酰丁香酮浓度：４０μｍ；⑤初始共培养时间：２天等的效果最佳．

陆地棉基因转移技术研究初报

应用农杆菌菌株Ａｔ４４０４携带抗卡那霉素基因（氨基葡萄糖磷酸转移酶）、Ｇｕｓ基因（葡萄糖苷酸酶）以及Ｂ．Ｔ毒蛋白基因，对陆地棉４个不同栽培品种鲁棉６号、鲁棉１０２４、中棉１２、中棉１９的无菌苗下胚轴和茎尖分生组织区作基因导入的研究，获得转基因的棉花试管苗．在以胚轴作为转化体系的培养过程中，只有鲁棉６号经过了愈伤组织发生、胚状体形成及植株再生途径．若以３～５ｄ的无菌苗芽顶端分生组织作为转化体系，经转化的茎尖分生组织培养在无激素或低浓度激素的ＭＳ培养基上，则可较容易地从多个品种中获得转基因的再生植株．以此方法进行基因转移，时间短、方法简便、不受品种来源及基因型的限制．

重组腺病毒载体介导外源基因转移至脑血管的实验研究

目的 基因载体直接体内转移血管壁为血管病的治疗提供一种新方法 ,本研究探讨腺病毒载体介导外源基因转移至颅内血管的可行性。方法 2 5 0 μl含巨细胞病毒启动子的编码报告基因 -绿色荧光蛋白 ( GFP)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体 ( Ad5CMV5GFP) ,滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l,经枕大池穿刺法注入正常兔的脑池内。注入腺病毒载体后 1～ 7d,采用荧光显微镜、免疫组织化学和逆转录聚合酶链式反应方法从形态学和分子生物学方面检测颅内血管和血管周围组织中外源基因 GFP的表达情况。结果 直接体内转染后 1d,在颅内大血管如基底动脉的外膜可见外源基因的表达 ,3d时减弱 ,7d后消失 ,而血管中膜和内膜未见外源基因的表达 ;注入腺病毒载体后1～ 7d,外源基因可以有效转移至颅底软脑膜细胞 ,小血管外膜和平滑肌层也可见外源基因的表达 ;注入腺病毒载体后兔体温未见升高 ,但是脑脊液中的白细胞数明显升高 ,血管壁中可见炎性细胞浸润。结论 经脑池内注入重组腺病毒载体可以将外源基因转移至正常兔颅内血管和软脑膜中 。

甜瓜抗CMV转基因植株的分子生物学研究

本研究建立了转目的基因植物基因整台及表达的分子生物学鉴定系统，并用报告基因检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ特异扩增、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法，研究了用叶盘法经Ｔｉ质粒转化的甜瓜再生植株ＣＭＶ－ＣＰ基因的整合与表达。结果表明：再生植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因，长度为１ｋｂ，并能有效表达。表达产物分子量为２４Ｋｄ，确为ＣＭＶ的外壳蛋白，其表达量占细胞总蛋白约５％。

苹果基因转移技术研究初报

应用农杆菌EHA101,携带抗卡那霉素基因(氨基葡糖磷酸转移酶)和GUS基因(葡糖苷酸酶),对苹果品种‘Greensleeves’作基因导入获得成功,提出了应用农杆菌与苹果叶片外植体共培养并经卡那霉素筛选后,早期检测出已导入外源基因的愈伤组织。然后,通过愈伤组织增殖和应用TD7诱导获得不定芽,从而获得转基因的苹果试管苗。这一技术将有利于提高获得转基因植株的成功率。

含Ⅰ型单纯疱疹病毒包装信号序列片段的分离及扩增子质粒双表达载体的构建

利用基因工程技术分离出含有Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV－1）包装信号序列和HSV－1基因组复制起点序列的片段，表达外源基因所必需的启动子序列以及其下游作为报告基因的lacZ基因片段，构建成质粒型HSV－1载体pHSVL。用脂质体介导的方法可将该质粒转染入经辅助病毒HSV－1tsK株超感染的Vero细胞，并将其包装成HSV－1假型病毒颗粒，可如天然病毒一样再感染传代细胞和神经细胞并在其中进行基因表达。在pHSVL的基础上，我们还构建了一种可同时表达两种外源基因的质粒型疱疹病毒载体pHLCL，即在pHSVL中插入第二个转录单位：HCMVIE启动子和其下游的荧光素酶基因（lucgene），由此获得的pHLCL病毒接种传代细胞证明它可在其中同时表达两种报告基因．本研究成功地构建了两种质粒型HSV－1载体，其独特的基因转移方式使之在神经生理、病理及神经系统疾病的基因治疗的实验研究中都具有广阔的应用前景。

人类基因治疗的研究进展

人类基因治疗是遗传工程在人类疾病治疗方面的应用，该方法是应用遗传工程的方法，将正常基因导入患者的体细胞内，使其在细胞内得到一定的表达，产生正常的基因产物以补尝或修正突变基因的功能，从而使人类的遗传病得到根治，本文对人类基因治疗研究中受体细胞的研究、基因转移方式等方面的最新研究进展作一综述，并对其存在的问题及应用前景进行了初步展望．

人DNA MTase反义基因转染诱导E-钙黏附蛋白高表达

目的 观察人DNAMTase反义基因转染后肝癌细胞系SMMC 772 1E 钙黏附蛋白表达的变化。方法 用基因重组技术构建包含人DNAMTase正、反义基因片段的真核表达载体 ;采用脂质体法将其转染入肝癌细胞系SMMC 772 1;采用RT PCR法观察DNAMTase基因mRNA、E 钙黏附蛋白基因mRNA表达变化 ;以甲基化特异的PCR法检测E 钙黏附蛋白基因启动子区域甲基化状态的改变 ;以免疫组化和流式细胞法检测E 钙黏附蛋白表达变化。结果 正、反义真核表达载体构建成功并转染入SMMC 772 1细胞 ,其中DNAMTase基因mRNA表达减低 ,E 钙黏附蛋白基因mRNA表达上调 ,E 钙黏附蛋白基因启动子区域呈现去甲基化状态 ,E 钙黏附蛋白表达上调。结论 抑制DNAMTase基因的表达可使肝癌SMMC 772 1细胞中E 钙黏附蛋白基因启动子区域去甲基化和表达增加 ;DNAMTase通过诱导启动子区域高甲基化 ,可使E