神经胶质成熟因子-β对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能机制

目的 探讨神经胶质成熟因子-β(GMFB)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能作用机制。方法 采用腹腔注射链脲佐菌素(55 mg·kg-1)的方法制备雄性SD大鼠的糖尿病模型,并按照随机数字表法分成STZ组、STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组,每组15只。另取15只正常大鼠作为CON组。STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠于成模8周后玻璃体内单次注射AAV-GMFB腺病毒载体5μL;STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠在注射腺病毒基础上给予腹腔注射colivelin(2 mg·kg·d-1),共注射4周;CON组和STZ组大鼠腹腔注射2 mL生理盐水。成模12周后,免疫荧光染色检测GMFB在Müller细胞中的表达,免疫组织化学染色检测GFAP的表达,ELISA检测视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量,Western blot检测视网膜中GMFB、p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达。结果 GMFB在STZ组Müller细胞中与GS大量共定位。与CON组相比,STZ组大鼠视网膜中GFAP表达增加,TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量及GMFB、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均明显增加(均为P<0.05),视网膜神经节细胞排列紊乱,数量明显减少;与STZ组相比,STZ+AAV-GMFB组大鼠视网膜中GFAP表达明显降低,TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量及GMFB、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.05),视网膜神经节细胞排列整齐,数量明显增加。STZ+AAV-GMFB+colivelin组能大部分逆转AAV-GMFB的保护作用。结论 敲减GMFB基因能抑制糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的活化,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。

胶质细胞成熟因子对培养的中枢大胶质细胞发育和分化的影响

用胶原酶和胰酶分离7天大鼠视神经胶质细胞,培养在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,培养液用仅含0.5％胎牛血清的B-S培养基(B-S/0.5％FCS,Bottenstein and Sato,1979)。把盖玻片培养物分为Ⅰ、“Ⅰ+GMF”、Ⅱ和“Ⅱ+GMF”4组,Ⅱ和“II+GMF”组分别与单层成胶质细胞联合培养,“Ⅰ+GMF”和“Ⅱ+GMF”组的培养液内添加胶质细胞成熟因子(GMF)250ng/ml,Ⅰ和Ⅱ组的培养液不加GMF。用单克隆抗体A2B5与抗半乳糖脑苷脂(GC)单克隆抗体,或A285与抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行双标记间接免疫荧光染色,以鉴別视神经培养物中的双潜能胶质祖细胞(A2B5^+,GC^-;或A2B5^+,GFAP^-)、成熟少突胶质细胞(A2B5^-,GC^+)、未成熟少突胶质细胞(A2B5^+,GC^+)、1型星形胶质细胞(A2B5^-,GFAP^+)和2型星形胶质细胞(A2B5^+,GFAP^+)。培养第5天,“Ⅱ+GMF”组的细胞数目有显著性增加(P<0.02),Ⅰ组细胞数目比其余3组低。在B-S/0.5％FCS培养基中,各组的双潜能胶质祖细胞均迅速分化为少突胶质细胞,但在Ⅰ和Ⅱ组以成熟少突胶质细胞为主,而在“Ⅰ+GMF”和“Ⅱ+GMF”组则未成熟少突胶质细胞较多。以上实验结果提示:GMF和成胶质细胞分泌的因子有刺激双潜能胶质祖细胞增殖导致生成大量少突胶质细胞及支持其生存的作用。但在此过程中,成胶质细胞分泌的因子明显促进少突胶质细胞分化成熟,而GMF却呈现抑制或延缓其成熟的作用。

神经胶质成熟因子γ抑制人结直肠癌LoVo细胞增殖并影响人脐静脉内皮细胞的骨架运动

背景:神经胶质成熟因子γ(glia maturation factor-gamma,GMFG)是细胞骨架运动重建过程中ADF/cofilin超家族蛋白成员之一,可以通过调节肌动蛋白介导细胞骨架重组参与细胞运动的调控。作者前期发现GMFG的高表达与结直肠癌肿瘤患者临床病理相关,但具体的上游及下游机制有待探究。目的:探索GMFG对人脐静脉内皮细胞骨架及LoVo细胞增殖的影响。方法:①将人脐静脉内皮细胞接种在激光共聚焦皿中,待细胞贴壁稳定生长后,细胞免疫荧光染色观察GMFG的表达与人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin表达的关系;然后加入秋水仙素抑制细胞有丝分裂,分为对照组、0.5 mg/L秋水仙素组、1.0 mg/L秋水仙素组,流式细胞术观察3组细胞周期的变化,Western blot蛋白印迹观察3组细胞GMFG蛋白表达;②将人结直肠癌LoVo细胞接种在激光共聚焦皿中,待细胞贴壁稳定生长后,细胞免疫荧光染色观察GMFG的表达与细胞周期的相关性,然后采用siRNA技术干扰LoVo细胞中GMFG的表达,分为空白对照组、空转染组和siRNA-GMFG组,Edu实验检测细胞增殖率的变化。结果与结论:①在人脐静脉内皮细胞中,GMFG的表达与人脐静脉内皮细胞骨架运动有关,细胞骨架回缩时GMFG表达增多;秋水仙素抑制人脐静脉内皮细胞有丝分裂后,随秋水仙素用量增加G2/M期细胞占比增加,GMFG蛋白表达下降;②在LoVo细胞中,GMFG的表达强度与细胞有丝分裂有关,在细胞有丝分裂中后期GMFG表达增强;③siRNA技术干扰LoVo细胞GMFG表达后,细胞增殖率下降;④结果表明,干扰GMFG表达能够抑制人结直肠癌LoVo细胞的增殖率,并且细胞骨架运动与GMFG的表达存在一定的相关性。

GMFB在氧化应激诱导的ARPE19细胞中的表达及意义

目的 探讨胶质细胞成熟因子beta（GMFB）在氧化应激诱导的ARPE19细胞中的表达及意义。方法 用0、0.25、0.5、1、2 mmol乙二醛处理ARPE19细胞24 h,其中对照组用0 mmol/L乙二醛处理,实验组以0.25~2 mmol/L乙二醛处理,用Western印迹法检测GMFB的表达;实验组用1μg/ml GMFB处理ARPE19细胞24 h,对照组不做处理,进行RNAseq,比较实验组和对照组基因表达的差异,选取其中表达差异大于1.5倍且P〈0.05的基因作为差异表达的基因,对其进行GO及KEGG富集分析。结果 经乙二醛处理的各组ARPE19细胞GMFB表达上调,以0.5 mmol/L处理组的GMFB上调最为显著。对GMFB处理的ARPE19细胞进行全基因表达谱检测,结果显示,在被检测的19 966个基因中,实验组和正常组间有显著差异表达（改变1.5倍）的基因有583个。与对照组相比,实验组基因表达显著上调的有265个,下调的有318个。GO分析表明,GMFB与细胞代谢、细胞催化等生物过程相关。KEGG分析显示,GMFB与细胞代谢通路、癌症通路、Wnt信号通路、趋化因子信号通路等多条信号通路密切相关。炎症基因CCL26、CXCL8和NF-κB1表达升高,提示GMFB与炎症相关。结论 GMFB在氧化应激诱导的ARPE19细胞中表达明显上调,GMFB可能影响细胞间连接,参与Wnt信号通路、肿瘤相关信号通路和趋化因子信号通路等。

GMFB在高糖处理的Müller细胞中的表达及其对Müller细胞的影响

目的:利用高糖处理Müller细胞,研究高糖条件下胶质细胞成熟因子B(glia maturation factor-β,GMFB)的表达情况和GMFB对Müller细胞的影响,揭示GMFB细胞在糖尿病视网膜病变中可能的作用机制,为糖尿病视网膜病变的治疗提供新的策略。方法:(1)用25mmol/L葡萄糖处理Müller细胞0,1,2,4和6 h,采用Western Blot检测GMFB的表达;(2)用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染Müller细胞后,1μg/ml重组蛋白GMFB处理Müller细胞0,2,4,8,12 h,采用Western Blot和免疫荧光检测自噬情况;(3)1μg/ml GMFB处理Müller细胞24 h为实验组,以未处理组作为对照组,进行RNAseq,检测其基因差异表达谱,选取其中表达差异大于1.5倍且P<0.05的基因作为差异表达的基因,对其进行基因本体论(gene ontology,GO)分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果:(1)经高糖处理的Müller细胞早期出现GMFB表达上调,以2 h处理组的GMFB上调最为显著,提示高糖刺激早期能引起Müller细胞的GMFB表达升高;(2)重组蛋白GMFB处理Müller细胞后,Western Blot在第4 h检测到自噬被诱导,但很短暂。我们在24 h用免疫荧光检测,没有发现红绿荧光强度变化,提示双标自噬系统检测未检测到自噬发生,可能与不同检测方法的敏感性不同有关。(3)对GMFB处理24 h的Müller细胞抽提总RNA,进行RNAseq检测,显示在被检测的14411个基因中,实验组和正常组间有显著差异表达的基因有152个。与对照组相比,实验组基因表达显著上调的有103个,下调的有44个。通过GO分析表明,GMFB与细胞代谢、细胞催化等生物过程相关。KEGG分析进一步发现GMFB与细胞黏附分子、轴突导向和胞质DNA感受通路等多条信号通路密切相关。同时,炎症基因IL-33表达降低,提示GMFB有神经保护的作用。结论:GMFB在高糖诱导的Müller细胞中表达明显上调,说明GMFB可能影响细胞间连接,参与炎症反应信号通路等。该工作为理解GMFB在糖尿病视网膜病变中的作用机制提供了有益的线索。GMFB在糖尿病视网膜病变的作用机制需要进一步验证。

赤芍总苷通过调控miR-338-3p/GMFB表达对结直肠癌SW-480细胞增殖、凋亡、迁移的影响

目的:探讨赤芍总苷(total paeony glucosides,TPG)通过调控miR-338-3p/胶质细胞成熟因子β(glia maturation factorβ,GMFB)表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响。方法:体外培养人结直肠癌SW-480细胞株,使用不同浓度的TPG处理细胞,平板克隆实验检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞划痕实验检测细胞迁移,Transwell实验检测细胞侵袭,qRT-PCR检测细胞中miR-338-3p和GMFB的表达,双荧光素酶报告基因检测miR-338-3p和GMFB的靶向关系。结果:与对照组比较,TPG低剂量组、中剂量组和高剂量组的克隆形成数量、细胞愈合率、迁移数量明显降低(P<0.001),其中TPG高剂量组的克隆形成数量、细胞愈合率和迁移数量降低最明显;与对照组比较,TPG低剂量组、中剂量组和高剂量组的细胞凋亡率显著增加(P<0.001),其中TPG高剂量组的细胞凋亡率增加最明显;与对照组比较,TPG低剂量组、中剂量组和高剂量组的miR-338-3p表达明显升高(P<0.001),其中TPG高剂量组的miR-338-3p表达升高最明显;与对照组比较,TPG低剂量组、中剂量组和高剂量组的GMFB mRNA表达显著降低(P<0.001),其中TPG高剂量组的GMFB mRNA表达降低最明显;与miR-con组比较,anti-miR-338-3p组的克隆形成数量、细胞愈合率和迁移数量显著增加,细胞凋亡率明显降低(P<0.001);miR-338-3p显著降低GMFB-WT的荧光素酶活性(P<0.05),但对GMFB-MUT的荧光素酶活性没有产生影响(P>0.05);与TPG高剂量+miR-con组比较,TPG高剂量+anti-miR-338-3p组的克隆形成数量、细胞愈合率和迁移数量明显升高,细胞凋亡率显著下降(P<0.001)。结论:TPG可能通过调控miR-338-3p/GMFB抑制结直肠癌细胞的增殖、凋亡、迁移。

星形胶质细胞瘤中神经胶质细胞成熟因子β和Ki-67表达的相关性及其在预后评估中的意义

目的了解星形胶质细胞瘤中神经胶质细胞成熟因子β(glia maturation factor-β,GMF-β)和Ki-67表达的相关性,并探讨GMF-β/Ki-67联合检测应用于胶质瘤预后评估的意义。方法收集陆军军医大学(原第三军医大学)西南医院2006—2009年胶质瘤病例140例(WHOⅡ~Ⅳ级)的组织样本、临床病理信息和3年随访资料;免疫组织化学单标、双标染色检测肿瘤细胞GMF-β和Ki-67的表达,统计学分析两者的相关性以及对患者预后的影响。结果星形胶质细胞瘤GMF-β表达水平与肿瘤级别、Ki-67表达均相关(均P<0.05);Kaplan-Meier生存率分析显示,GMF-β、Ki-67表达水平分别与患者3年生存率呈负相关(均P<0.01)。进一步分析证实两者共同影响生存期长短,呈现GMF-β低表达+Ki-67低表达组>GMF-β高表达+Ki-67低表达组>GMF-β低表达+Ki-67高表达组>GMF-β高表达+Ki-67高表达组的3年生存率趋势,组间差异均有统计学意义(分别P<0.05,P<0.01)。结论星形胶质细胞瘤GMF-β和Ki-67的表达水平正相关,GMF-β/Ki-67联合检测可应用于胶质瘤的临床预后评估。

miR-34a-5p靶向GMFB抑制细胞增殖对先天性巨结肠的治疗意义

目的探讨miR-34a-5p通过靶基因GMFB调控神经嵴细胞的增殖。方法通过荧光定量PCR检测miR-34a-5p在先天性巨结肠症(HSCR)和正常结肠组织中的表达,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-34a-5p的靶基因,SH-SY5Y细胞转染miR-34a-5p mimics及对照miR-NC,并转染GMFB表达载体,通过CCK8检测miR-34a-5p和GMFB对神经嵴细胞增殖的影响,并通过Western Blot检测miR-34a-5p对GMFB蛋白表达的影响。采用t检验和单因素方差分析。结果荧光定量PCR结果显示,HSCR结肠组中miR-34a-5p的相对表达量为0.43±0.10,低于正常结肠组1.15±0.18,差异具有统计学意义(t=3.50,P <0.01)。CCK8结果显示,miR-34a-5p mimics组细胞在培养24 h和48 h后细胞A450值分别为0.53±0.03和0.87±0.04,低于miR-NC对照组0.87±0.03,1.42±0.04。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-34a-5p mimics与GMFB 3'UTR WT载体共转染组荧光强度为0.44±0.03,低于对照miRNC与WT载体共转染组1.02±0.06。CCK8结果所示,miR-34a-5p mimics+GMFB组细胞培养24 h和48 h后,A450值分别为0.99±0.02和1.50±0.03,高于miR-34a-5p mimics组0.53±0.03,0.87±0.04,差异具有统计学意义(t=7.07,P <0.01;t=9.14,P <0.01)。Western Blot检测结果显示,miR-34a-5p mimics组细胞的GMFB蛋白表达量为0.25±0.01,低于miR-NC对照组0.90±0.03,差异具有统计学意义(t=35.60,P <0.01),miR-34a-5p mimics+GMFB组细胞GMFB蛋白表达量为1.03±0.03,高于miR-34a-5p mimics组0.25±0.01,差异具有统计学意义(t=42.74,P <0.01)。结论 miR-34a-5p能够通过抑制靶基因GMFB的表达,抑制神经嵴细胞SH-SY5Y的增殖。

胶质细胞成熟因子β在肝细胞癌中的表达及其临床意义

背景与目的:胶质细胞成熟因子β(GMFB)是一种17 kDa、高度保守的脑蛋白,近年来研究发现,GMFB在多种恶性肿瘤中表达上调且与患者的不良预后密切相关。然而,GMFB在肝细胞癌(HCC)中的表达及其作用的研究尚不够深入。本研究通过检测GMFB在HCC组织中的表达,分析其与患者临床病理特征、预后以及Ki-67表达的关系,探讨GMFB在HCC中的临床意义。方法:用qRT-PCR和Western bolt方法检测36对新鲜冷冻HCC组织及其癌旁组织中GMFB的mRNA和蛋白的表达。用免疫组化法分别检测91例HCC组织及其癌旁组织石蜡组织标本中GMFB和Ki-67蛋白的表达,用统计学方法分析GMFB与HCC患者临床病理因素、术后生存时间的关系以及与Ki-67表达的相关性。结果:qRT-PCR和Western bolt结果显示,HCC组织中GMFB mRNA与蛋白的相对表达量较癌旁组织均明显升高(均P<0.001)。免疫组化结果显示,GMFB和Ki-67在HCC组织中的阳性表达率均较癌旁组织明显升高(均P<0.001);GMFB的表达与HCC微血管侵犯(P=0.045)、Edmondson分级(P=0.032)、BCLC分期(P=0.012)明显有关;在HCC组织中,GMFB和Ki-67的表达呈正相关(rs=0.265,P=0.011)。Kaplan-Meier生存分析显示,GMFB阳性表达患者的无病生存时间(DFS)及总生存时间(OS)均明显短于GMFB阴性表达患者(DFS:4.52个月vs.10.48个月,P=0.001;OS:27.67个月vs.39.75个月,P=0.007);Cox多因素回归模型分析显示,GMFB与Ki-67的表达上调是影响HCC患者DFS(HR=0.441,95%CI=0.242~0.801,P=0.007;HR=1.818,95%CI=1.012~3.269,P=0.046)与OS(HR=0.504,95%CI=0.287~0.886,P=0.017;HR=1.787,95%CI=1.083~2.935,P=0.023)的独立危险因素。结论:GMFB在HCC中呈现高表达,且与HCC进展及患者的不良预后密切相关,GMFB的表达与Ki-67的表达呈正相关,故推测其可能通过对肿瘤细胞增殖活性的调控发挥作用。