人嗜酸性粒细胞NADPH氧化酶的定位及gliotoxin的抑制作用

目的研究NADPH氧化酶在人体嗜酸性粒细胞中的细胞化学定位及gliotoxin对其活性的抑制作用。方法用蛋白激酶C的激活剂佛波豆蔻乙酯(phorbol myristate aceta,PMA)和gliotoxin对嗜酸性粒细胞预处理,然后用Ce3+为捕捉剂检测活性氧,作为电镜下NADPH氧化酶活化的标志。结果PMA组:在嗜酸性粒细胞内囊泡呈放射状排列,大小形态各异的囊泡腔面有很多显示NADPH氧化酶活性的致密颗粒存在。PMA+gliotoxin组:嗜酸性和中性粒细胞内显示该酶活性的颗粒都明显减少,但后者减少程度明显。结论嗜酸性粒细胞经刺激后,位于细胞内囊泡膜的腔面的NADPH氧化酶被激活,其活性强于中性粒细胞。gliotoxin对嗜酸性粒细胞产生过量.O2-有明显的抑制作用。

恒山黄芪内生真菌Penicillium sp.中gliotoxin类代谢产物的分离和生物活性

目的:研究恒山黄芪内生真菌Penicillium sp.的gliotoxin类代谢产物和其对黄芪白粉病原菌Erysiphe pisi.的抑制作用。方法:次生代谢产物的分离纯化采用反复硅胶柱色谱法,Sephadex LH-20凝胶色谱法和HPLC方法,并通过化学方法结合核磁共振分析和质谱鉴定其化学结构,抑菌活性测试方法采用最小抑制浓度法。结果:从恒山黄芪内生真菌Penicillium sp.的固体发酵萃取物中分离得到7个gliotoxin类代谢产物,经波谱分析分别鉴定为gliotoxin(1),bisdethiobis(methylthio)gliotoxin(2),dehydroxybisdethiobis(methylthio)gliotoxin(3),dehydrogliotoxin(4),6-deoxy-5a,6-didehydrogliotoxin(5),didehydrobisdethiobis(methylthio)gliotoxin(6),bis-N-norgliovietin(7),抑菌活性测试结果显示,化合物1,4和5对黄芪白粉病原菌显示出强抑制作用,最小抑菌浓度(MIC)分别达到1.56,0.78,6.25 mg·L-1。结论:所有化合物都是首次从黄芪内生真菌发酵产物中分离得到,黄芪内生真菌Penicillium sp.可以作为潜在的产生gliotoxin类代谢产物的菌种资源。

海洋来源真菌烟曲霉中胶霉毒素类成分研究

为了从海洋来源的微生物中寻找新的抗肿瘤活性天然产物,对一株具有较强细胞毒活性的海洋来源真菌烟曲霉进行系统分离研究,以抗肿瘤活性为指标,采用硅胶柱层析、葡聚糖凝胶LH-20和HPLC等方法从中分离出4个单体化合物,经波谱数据分析及与文献对照分别鉴定为gliotoxin(1),bisdethiobis(methylthio)gliotoxin(2),d idehydrobisdethio-bis(methylthio)gliotoxin(3)和bis-N-norgliovictin(4),其中化合物(1)在0.15 mg/L浓度下对温敏型小鼠乳腺癌细胞(tsFT 210)显示了很强的细胞毒活性.

真菌菌株sf1760农用活性物质的分离、纯化及LC/MS分析

采用液体发酵,冷冻干燥,萃取,HPLC半制备,生物测定,HPLC纯化,活性物质的LC/MS/MS分析研究真菌菌株sf1760发酵活性物质的主要成分。结果从真菌菌株sf1760中提取得到两个组分具有抑制作物病原真菌的作用,经LC/MS/MS分析组分1的紫外吸收峰为264nm,其母离子ESI+316.6,ESI-314.8;其子离子ESI+263.6,ESI-261.7,与Gliotoxin的紫外和质谱信息相同。组分2的紫外吸收峰为210nm,其质谱ESI+444.8,子离子为ESI+228.6,ESI+199.6;ESI-442.9,子离子为ESI-240.6,与Fumiquinazo-line C的紫外和质谱信息相同。

黄花蒿内生真菌SPS-02的鉴定和次生代谢产物研究

以黄花蒿（Artemisia annua L.）来源的一株内生真菌SPS-02为研究对象,分别进行了拮抗试验、分类鉴定和次生代谢产物研究。通过形态和培养特征观察及系统发育树构建,菌株SPS-02确定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。拮抗试验结果表明,菌株SPS-02能较强地抑制植物病原真菌。通过菌株SPS-02次生代谢研究,得到4个单体化合物（1~4）,采用波谱技术确定为bisdethiobis（methylthio）-gliotoxin（1）、N-（2,4-dihydroxybenzoyl）-L-Serine（2）、2,4-dihydroxybenzoic acid（3）、2H-Benzopyran-2,5（6H）-dione（4）,其中化合物1、3和4具有较强的抑制白色念珠菌（Canidia albicans）,MIC值分别为0.90、2.08和1.98μM,并且化合物1（胶霉毒素）产量较丰富,初始效价约为15 mg/L,具有一定的应用价值。

螳螂共生真菌TG-3次生代谢产物的研究

目的对螳螂共生真菌TG-3的次生代谢产物进行研究。方法采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相等方法对TG-3发酵液的乙酸乙酯提取物进行分离和纯化,并运用波谱学方法鉴定化合物的结构。结果从发酵产物中分离得到8个化合物,分别鉴定为1,4-dimethyl-3[(4'-γγ-dimethylallyloxyphenyl)methyl]-3,6-bis(meth-ylthio)piperasine-2,5-dione(1)、fusaperazine E(2)、cyclo-(Gly-Tyr)4,4-dimethylallyl ether(3)、bisdethiobis(methylthio)gliotoxin(4)、胶酶毒素(5)、didehydrobisdethiobis(methylthio)gliotoxin(6)、邻苯二甲酸二丁酯(7)、尿嘧啶(8)。结论以上化合物均为首次从TG-3中分离得到。

盐胁迫对胶霉毒素生物合成基因gliT表达的影响

从烟曲霉菌株F3中克隆得到gliT基因(胶霉毒素生物合成基因簇成员之一),其编码产物GliT是一个假定的硫氧还蛋白还原酶,含有保守的Pyr_redox和TrxB结构域,与来自于烟曲酶菌株Af293的GliT在氨基酸水平上的同源性高达97%。不同盐浓度培养条件下,烟曲霉菌株F3中gliT基因的表达变化与发酵液中胶霉毒素的含量变化之间存在着明显的相关性,均在盐浓度70 g/L培养条件下达到峰值,提示gliT基因在胶霉毒素生物合成过程中的作用可能与盐胁迫有关。

伽玛刀照射诱导C_6脑胶质瘤凋亡及其癌基因c-myc、P_(16)蛋白表达的变化

目的 探讨伽玛刀照射诱导 C6 脑胶质瘤细胞凋亡及其相关癌基因变化。方法 C6 脑胶质瘤细胞经伽玛刀照射后光镜及电镜下观察细胞凋亡 ,采用免疫组化技术检测原癌基因 c- myc、抑癌基因 P1 6 蛋白表达的变化。结果 小剂量γ射线可诱导瘤细胞凋亡 ,而大剂量γ射线引起细胞坏死 ,处理组 c- myc、P1 6 基因在蛋白水平表达率明显高于对照组 (P<0 .0 5 )。结论 原癌基因 c- myc、抑癌基因 P1 6 在辐射诱导凋亡中起重要作用。本研究为临床放疗方案的优化、减轻放疗的副作用等提供参考。

曲霉菌素诱导人胚肾细胞毒性机制(英文)

目的 研究曲霉菌素诱导人胚肾细胞毒性作用机制。方法 结晶甲紫法用于细胞存活率研究。琼脂糖凝胶及Burton法研究细胞核DNA断裂片段。以水解特异性底物Ac DEVD AMC活性为研究指标 ,测定胞浆半胱天冬酶 (caspase) 3类蛋白酶活性。采用蛋白质印迹法检测细胞半胱天冬酶 3蛋白表达。采用荧光标记探针、流式细胞仪技术研究细胞核DNA核型及细胞活性氧的产生。结果 曲霉菌素浓度依赖性地诱导人胚肾细胞凋亡 ,最大效应浓度为 1 .0mg·L-1 。BAF ,半胱天冬酶 3蛋白抑制剂和N 乙酰半胱氨酸 (活性氧抑制剂 )能显著性抑制曲霉菌素诱导人胚肾细胞凋亡作用。结论 半胱天冬酶类及活性氧调节曲霉菌素诱导的人胚肾细胞凋亡。

高效液相色谱-串联质谱法测定多种食品和饲料中的胶霉毒素

建立了加压溶剂萃取结合全自动固相萃取技术-高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定玉米和小麦等禾谷食品、猪的肌肉和肝脏等动物源食品及猪和鸡的饲料中胶霉毒素的液相色谱串联质谱法。前处理时依次采用加压溶剂萃取(pressurized liquid extraction,PLE)和全自动固相萃取(automated solid phase extraction,ASPE)技术,乙腈/水(50/50,V/V)为玉米、小麦及饲料样品的加压溶剂萃取液,乙腈/正己烷(60/40,V/V)为猪的肌肉和肝脏样品的加压溶剂萃取液,甲醇/水(85/15,V/V)为所有样品的全自动固相萃取洗脱液。HPLC-MS/MS检测,基质匹配工作曲线外标法定量。结果表明,不同样品中胶霉毒素在0.2~100μg/L范围内具有良好的线性关系,相关系数R2≥0.995 8;不同样品中的胶霉毒素最低检出限在0.09~0.15μg/kg,最低定量限在0.23~0.31μg/kg;添加不同浓度水平的胶霉毒素,平均回收率为81.8%~95.4%,变异系数≤13.2%。

深海真菌Dichotomomyces cejpii胶霉毒素生物合成基因启动子的克隆和功能鉴定

利用染色体步移技术对深海真菌Dichotomomyces cejpii中胶霉毒素的生物合成基因Gli G、Gli I和Gli O启动子进行克隆,并将其核心区域导入p GL3-basic荧光素酶报告基因载体,通过荧光强度分析发现Gli G的启动子转录活性最强。进一步将Gli G启动子核心区域导入含潮霉素抗性标记的p AN7-1载体,以替换原有启动子pgpd A,并将重组质粒导入酿酒酵母,用潮霉素抗性平板进行筛选,发现Gli G启动子能在酿酒酵母中启动潮霉素抗性基因的表达。

死亡受体通路在曲霉菌素诱导肝星状细胞凋亡中的作用

目的验证曲霉菌素诱导肝星状细胞HSC-T6凋亡的作用,探讨死亡受体通路在该过程中的意义。方法将HSC-T6细胞分为曲霉菌素干预组和空白对照组,用流式细胞术检测HSC-T6的凋亡,免疫组化SABC法检测Fas蛋白的表达,分光光度法检测caspase-8的活性。结果流式细胞术显示,曲霉菌素浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L,作用于干预组HSC-T6细胞1 h后,HSC凋亡指数与对照组相比显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),且随着曲霉菌素浓度增加,凋亡率也相应增高;曲霉菌素以最低有效浓度0.4 mmol/L干预,Fas的表达及caspase-8活性与空白对照组比较均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论曲霉菌素诱导HSC-T6细胞凋亡具有剂量依赖性,死亡受体通路在该过程中有重要意义。

一株产胶霉菌素菌株的ARTP诱变及筛选

试验旨在选育出胶霉菌素高产菌株,以胶霉菌素产生菌TY-009为初始菌株,利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对产胶霉菌素的绿色木霉菌株进行诱变处理,并设置时间梯度,检测不同处理时间样品的胶霉菌素产量。通过平板筛选以及摇瓶复筛选出8株正突变菌株,其中产率最高达到0.86 mg/m L,较初始菌株的产率提高了45.76%。ARTP诱变方法快速、高效,对绿色木霉菌株的诱变效果良好,在提高胶霉菌素产量方面有很好的应用前景。

响应面优化绿色木霉产胶霉菌素培养基

采用响应面法旨在优化绿色木霉产胶霉菌素培养基。试验选用Min Run Res IV设计对基础培养基的6个影响因子的效应进行评价,筛选显著影响因子,利用最陡爬坡试验确定其取值中心、中心组合试验确定其最佳取值,从而获得优化培养基。Min Run Res IV试验筛选出4个显著性影响因子:葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾和硫酸锌,经过最陡爬坡和中心组合试验,响应面分析得到最佳培养基组合为:葡萄糖26.54 g/L、酵母粉10 g/L、豆粕15.72 g/L、磷酸二氢钾0.452 g/L和硫酸锌0.0582 g/L、硫酸亚铁0.1 g/L,在最佳培养基下胶霉菌素效价较优化前提高了59.71%。

BBD-响应面法优化绿色木霉产胶霉菌素培养条件

旨在优化绿色木霉产胶霉菌素培养条件。实验取绿色木霉产胶霉菌素培养条件中的5个重要影响因子,设计5因素3水平的响应面分析实验,数据用Design-Expert 8.0分析得出预测模型,验证模型的可靠性后,得出绿色木霉产胶霉菌素最佳的培养条件为:培养温度29.42℃、培养基初始pH 6.35、接种量5.44%、培养时间54.5 h、菌龄44.5 h,且在最佳培养条件下胶霉菌素效价较优化前提高了15.08%。

胶霉毒素菌渣的抗菌活性及其应用的研究

旨在研究胶霉毒素菌渣对5种土传病菌的抑制性,寻找到一种胶霉菌素菌渣的综合利用方法。以辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、苹果腐烂病菌、油菜菌核病菌和棉花枯萎病菌为供试菌,采用菌丝生长速率法,对胶霉毒素菌渣的抑菌活性进行了研究,并比较了10%菌渣、10%豆粕、无豆粕和菌渣的培养基对木霉孢子和胶霉毒素含量的影响。以木霉干重孢子数为指标,确定了菌渣最佳添加量。胶霉毒素菌渣对5种土传病菌具有一定的抑菌效果,浓度为40 mg/mL时,对4种土传病菌菌丝的生长的抑制率为100%。胶霉毒素菌渣添加量为30%时,木霉的发酵效果最佳,其干重孢子数达到22亿/g。综上所述,胶霉毒素菌渣具有良好的抑制土传病菌生长的效果,且可作为氮源循环利用培养木霉。

三个木霉菌株防病促生效应

【背景】木霉(Trichoderma sp.)是重要的生防微生物资源,对不同的木霉菌株进行生物学特性比较,可为获得功能较广的复配型生防菌剂提供参考信息。【目的】通过对绿木霉(Trichoderma virens)T23、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T22、G30的防病效果及对作物的促生潜力等生物学特性进行比较分析,明确不同菌株的生物功能差异。【方法】用平板拮抗法比较分析菌株T23、T22、G30对植物病原真菌的拮抗效果;用乙酸乙酯萃取法对菌株T23、T22、G30培养液中的胶毒素进行提取并通过高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测胶毒素;用打孔法比较分析培养液萃取物对植物病原真菌的拮抗效果;通过温室接种验证菌株T23、T22、G30的防病效果;分别以磷酸钙、卵磷脂为唯一磷源检测菌株T23、T22、G30对难溶性磷的转化利用潜力,用电感耦合等离子发射光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry,ICP-AES)检测有效磷含量;用透明圈法或显色法分析菌株T23、T22、G30主要生理生化特性。【结果】菌株T23、T22、G30对茄镰孢(Fusarium solani)的平板拮抗率分别为77%、74%、48%;对齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的拮抗率分别为80%、67%、24%;对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的拮抗率分别为93%、62%、64%;菌株T22、G30基因组中均不携带胶毒素合成基因簇,培养液中均未检测到胶毒素;菌株T23培养液提取物对齐整小核菌、灰葡萄孢的抑菌率分别为40%、65%;温室接种结果表明,在齐整小核菌胁迫下,T23可显著提高花生成苗率,达68%;在灰葡萄孢胁迫下,菌株T23可使月季延迟16d发病;菌株T23、T22可以产生β-1,3-葡聚糖酶;菌株T23、T22、G30可对磷酸钙进行转化利用。【结论】通过比较分析,我们对菌株T23的防病促生效果及生理生化特性有了进一步了解。菌株T23、T22、G30在植物病原真菌拮抗、解磷效果方面各具特点及优势,菌株T23通过产生抑菌性天然产物来拮抗病原真菌,这为真菌源生物农药的开发提供了重要的来源。在促生方面,菌株T23的无机磷转化机制有待进一步研究。

海洋真菌Alternaria alternate YX-25和放线菌Streptomyces exfoliates YX-32共培养的次级代谢产物研究

目的研究来源于福建云霄红树林底泥中的链格孢霉属真菌AlternariaalternateYX-25和链霉菌属放线菌Streptomyces exfoliatus YX-32共培养产生的次级代谢产物。方法通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及半制备HPLC等色谱技术对共培养所产生的次级代谢产物进行分离纯化。采用MS和NMR等波谱方法及文献对比鉴定化合物的结构。结果从2株共培养的发酵产物中分离得到9个化合物,分别鉴定为gliotoxin(1)、12,13-dihydroxy-fumitremorgin C(2)、fumitremorgin(3)、bisdethiobis (methylthio) gliotoxin(4)、demethoxyfumitremorgin C(5)、vermistatin(6)、cyclo-(L-Trp-L-Pro)(7)、6-methoxyspirotryprostatin B(8)和citrinolactone D(9)。结论首次从海洋真菌Alternaria alternate YX-25和放线菌Streptomyces exfoliatus YX-32共培养发酵产物中发现了9个化合物,为吲哚二酮哌嗪类、聚酮类、环肽类化合物。共培养方法可使代谢产物丰富,可作为一种诱导次级代谢产物的新方法。

胶毒素与BSA的相互作用

应用荧光、圆二色和紫外—可见吸收等波谱法研究胶毒素与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。荧光光谱实验结果表明胶毒素主要靠疏水作用与BSA结合,而对其内源荧光产生猝灭作用,其淬灭方式为静态猝灭,胶毒素与BSA的结合常数为7.2×103L/mol。圆二色光谱检测发现,随着胶毒素浓度的增加,BSA的α-螺旋数量也增加,当胶毒素浓度为BSA浓度的100倍时,BSA的α-螺旋增加40.1%,表明胶毒素与BSA的结合改变了BSA的空间构象。