浑球红细菌谷氨酰胺合成酶基因(glnA)及PⅡ蛋白基因(glnB)的序列分析

测定了浑球红细菌的glnA和／glnB基因DNA序列，共2707nt。其中glnA基因编码区为1401nt，编码467个氨基酸；glnB基因编码区为336nt，编码112个氨基醚。DNA序列的G＋C百分含量为65％，它们的密码子第三位GC利用率高达89．1％。在氨基酸序列上，GS酶和PⅡ蛋白与其它不同属的细菌间有较好的同源性，尤其是固氮类细菌间同源性较高。

浑球红细菌（R．srhaeroides）glnBA基因克隆及其物理图谱

从浑球红细菌的基因文库中筛选到ｐＨＴ３、ｐＨＴ１０及ｐＨＴ３５三个阳性克隆，其中质粒ｐＨＴ１０与ｐＨＴ３５能遗传互补英膜红细菌的谷氨酰胺缺陷型Ｇ２９，使其ＧＳ酶及固氮酶活性得到恢复。对质粒ｐＨＴ１０上的ｇｌｎＡ同源片段进行了亚克隆和限制性内切酶图谱分析，确定了浑球红细菌ｇｌｎＢ与ｇｌｎＡ之间存在连锁关系。

巴西固氮螺菌Yu62 glnB基因的克隆及其功能分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中 ,筛选到glnB基因的阳性克隆 ,将3 7kb/EcoRI+PstI的阳性克隆亚克隆到pUC1 9中 ,进行了全序列分析 ,其在GenBank中的登记号是AF32 3960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因 ,glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶 (GS)的glnA基因 ,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长 336bp,编码 1 1 2个氨基酸 ,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达 71 %、77%、79%和 69%。将卡那霉素抗性片段 (Km -cas sette)插入glnB基因的BglII位点 ,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中 ,通过同源重组 ,获得GlnB- 突变株 (glnB ::Km)。为了进一步分析glnB基因的功能 ,将glnB基因的编码区 ( 339bp)构建在pVK1 0 0中 ,置于Km启动子下组成型表达 ,形成重组质粒pVK -II。将重组质粒pVK -II转入到GlnB- 突变株 ,构建成互补株C -glnB(glnB ::Km/glnB)。对GlnB-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明 ,GlnB- 突变体无固氮酶活性 ,即表型为Nif- ;而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK -II分别转移到野生型Yu62?

巴西固氮螺菌中P_Ⅱ和P_Z在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌 (Azospirillumbrasilense)中 ,glnB和glnZ是两个高度同源基因 ,分别位于 3 7kb EcoRI+PstI和 3 7kb SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒 (Kmr cas sette)插入法 ,对glnB和glnZ分别进行定位诱变 ,并获得相应的突变株 ,即glnB- 和glnZ- 。研究表明 ,glnB- 突变株丧失固氮酶活性 ,表现为Nif- ,而glnZ- 象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能 ,将glnB和glnZ分别构建在pVK1 0 0载体上形成重组质粒pVK -Ⅱ和pVK -Z ,对glnB- 和glnZ- 突变株进行互补实验 ,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性 ,而glnZ无此作用。同时 ,通过三亲接合法将pVK -Ⅱ和pVK -Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT- 突变株中 ,使glnB和glnZ的拷贝数增加 ,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因 ,能显著提高固氮酶活性 ,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时 ,将pVK Ⅱ和pVK -Z分别转移到nifA- 突变株中 ,结果表明glnB和glnZ均不能恢复nifA-