糖基因GLT25D1和GLT25D2缺失对APAP诱导的急性药物性肝损伤的影响

目的 研究糖基因Glt25D1和Glt25D2在对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导的急性药物性肝损伤中的可能作用及机制.方法 抽取6~8周雄性糖基因Glt25D1和Glt25D2敲除小鼠(Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-))及野生型小鼠(Wild type,WT),构建药物性肝损伤模型.实验组腹腔内注射500 mg/kg APAP,对照组给予相同剂量生理盐水.造模6 h后处死小鼠.检测小鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平,观察肝组织病理.分离提纯小鼠肝原代细胞,分别加APAP和衣霉素(Tunicamycin,Tm)刺激6 h后收取细胞,提取细胞蛋白和RNA.q-PCR、Western印迹检测小鼠肝脏组织及原代肝细胞Glt25D1和Glt25D2、内质网应激相关蛋白、凋亡相关蛋白、炎性因子的表达变化趋势.结果 Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-)造模组小鼠ALT和AST水平均显著高于WT造模组.小鼠肝脏HE染色可见,Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-)造模组小鼠肝损伤程度比WT造模组更严重.Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-) APAP造模组GRP78、chop以及cleaved caspase-12、cleaved caspase-3等内质网应激相关蛋白的表达量高于WT造模组,同时伴有线粒体细胞色素C的释放.结论 Glt25D1和Glt25D2基因敲低加重小鼠APAP诱导的急性肝损伤,促进内质网应激,促进肝细胞凋亡.

HBV相关糖基转移酶Glt25D2的核苷酸单糖结合活性分析

目的体外克隆表达人类糖基转移酶Glt25D2,利用Biacore分析系统对其活化单糖及钙离子结合活性进行分析。方法构建Glt25D2原核表达载体pET32a-Glt25D2,转化大肠埃希菌BL21,克隆表达糖基转移酶Glt25D2。离心集菌,制备蛋白样品,进行SDS-PAGE电泳分析;融合蛋白线性梯度洗脱,Ni-NTA柱纯化,后做Western blot鉴定。用纯化后的Glt25D2融合蛋白包被CM5芯片,分别用不同浓度的活性单糖及钙离子灌注芯片,利用Biacore生物分子相互作用分析仪分析Glt25D2的活化单糖及钙离子结合活性。结果体外成功表达人类糖基转移酶Glt25D2融合蛋白。Biacore分析显示,该糖基转移酶与400、200、100、50μg/ml唾液酸的结合活性分别为108、71、50和20 RU,与200、100、50、0μg/ml钙离子的结合活性分别为37、20、10和0 RU。结论人类糖基转移酶Glt25D2重组蛋白具有较强的钙离子及唾液酸结合活性。

O-糖基转移酶、Glt25D2与乙型肝炎包膜蛋白大蛋白的分泌有关

目的在前期研究结果提示Glt25D2与HBV包膜蛋白大蛋白(LHBs)在体外相互作用基础上证明Glt25D2是否与HBV LHBs分泌相关。方法采用激光共聚焦方法分析Glt25D2与LHBs在HepG2细胞内的定位。免疫共沉淀方法进一步证实Glt25D2与LHBs的相互作用。采用实时荧光定量PCR和Western blot方法分析mRNA和蛋白表达水平。应用ELISA方法检测细胞上清LHBs水平。实时荧光定量PCR方法检测上清HBV病毒载量。ELISA方法检测上清HBV LHBs水平。Western blot方法检测细胞中LHBs蛋白含量。Cobas Amplicor HBV Monitor Test方法检测细胞上清液HBV DNA载量。结果 Glt25D2与LHBs在体外相互作用,上调的Glt25D2高表达促进HBV DNA复制和LHBs表达,Glt25D2低表达抑制HBV DNA复制和LHBs表达。结论 Glt25D2与乙型肝炎包膜蛋白大蛋白的分泌有关。

GLT25D2基因在对乙酰氨基酚诱导肝毒性损伤中对自噬的调控作用

目的探讨GLT25D2基因在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝毒性损伤中是否对自噬有调控作用。方法选择GLT25D2/野生型C57B/J小鼠和GLT25D2/基因敲除C57B/J小鼠为研究对象。①体内实验：将20只野生型小鼠和20只GLT25D2/小鼠分别按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组和APAP干预组，每组10只。腹腔注射25 /的APAP溶液500 m/g建立小鼠肝毒性损伤模型；PBS对照组腹腔注射等量PBS。制模成功后立即处死小鼠取肝组织，采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测肝组织自噬相关蛋白ATG5、ATG7、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、P62的表达；电镜下观察肝组织超微结构改变，评估自噬水平。②体外实验：另取野生型小鼠和GLT25D2/小鼠各1只，采用两步胶原灌注法提取原代肝细胞并分为两部分：一部分以5 mmo/ APAP溶液干预0、8、12 h后收集细胞，采用Western Blot试验检测肝细胞自噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3、P62的表达；另一部分用绿色荧光蛋白-LC3质粒（GFP-LC3）转染24 h，分别给予PBS（PBS对照组）和5 mmo/ APAP（APAP干预组）温育12 h，荧光显微镜下观察GFP-LC3阳性表达以反映自噬体的形成情况。结果①体内实验结果显示：与相应PBS对照组相比，经APAP干预后，野生型及GLT25D2/小鼠肝组织中自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7、LC3 -Ⅱ表达下调，而负性相关蛋白P62表达上调，说明APAP处理后自噬整体水平降低。与野生型小鼠相比，GLT25D2/小鼠肝组织自噬正性相关蛋白ATG7、ATG5表达上调（ATG/-actin：1.21±0.29比0.84±0.19，ATG/-actin：1.29±0.14比1.54±0.40，均P〉0.05），LC3 -Ⅱ表达略下调（LC3 -/-actin：0.52±0.06比0.58±0.06，P〉0.05），而负性相关蛋白P62表达下调（P6/-actin：1.13±0.94比1.54±0.40，P〉0.05），说明基因敲除后小鼠自噬表达水平高于野生型小鼠。电镜下观察超微结构显示，与相应PBS对照组相比，经APAP干预后，野生型小鼠肝组织自噬体数量无明显变化，但GLT25D2/小鼠自噬体数量增多。②体外实验结果显示：随APAP干预时间延长，野生型及GLT25D2/小鼠原代肝细胞自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7表达逐渐上调，LC3略有波动，而负性相关蛋白P62表达逐渐下调，12 h分别达峰值或谷值，说明APAP刺激细胞自噬表达增强，并呈一定时间依赖性；与野生型小鼠相比，GLT25D2/小鼠12 h原代肝细胞自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7、LC3 -Ⅱ及负性相关蛋白P62表达上调（ATG/-actin：0.93±0.09比0.74±0.06，ATG/-actin：0.80±0.09比0.65±0.10，LC3 -/-actin：1.35±0.30比1.15±0.20，P6/-actin：0.36±0.02比0.31±0.03，均P〉0.05），说明基因敲除后自噬水平增强。荧光显微镜下观察显示，经APAP干预后，野生型及GLT25D2/小鼠原代肝细胞GFP-LC3阳性细胞均较PBS对照组明显增加；GLT25D2/小鼠GFP-LC3阳性细胞比例明显高于野生型小鼠（0.64±0.08比0.36±0.05，P〈0.05）。 结论GLT25D2是自噬负性调控因子，敲除GLT25D2基因能够增强APAP诱导肝毒性损伤小鼠的自噬水平。