新疆乌什县绵羊羊蜱蝇巴尔通体检测及gltA基因分析

试验旨在掌握新疆乌什县绵羊体外寄生羊蜱蝇所携带巴尔通体的感染状况,随机从乌什县绵羊体表采集羊蜱蝇78只,应用数码体视显微镜对羊蜱蝇进行初步形态学鉴定,对羊蜱蝇18S rRNA基因以及巴尔通体病原gltA基因运用分子生物学技术进行PCR扩增,测序结果应用序列分析软件MEGA 7.0构建系统发育进化树并进行遗传进化分析。结果显示,采集物种为羊蜱蝇并检测到其携带巴尔通体,经鉴定为蜱蝇巴尔通体(Bartonella melophagi)。研究表明,乌什县绵羊羊蜱蝇携带巴尔通体病原,结果可为新疆地区巴尔通体的研究提供数据支撑。

西藏羊蜱蝇中巴尔通体检测及gltA基因序列分析

为了明确西藏部分地区绵羊体外寄生羊蜱蝇携带病原巴尔通体的感染情况,作者于2019年1—9月采集了西藏林芝、日喀则、那曲地区绵羊体外寄生羊蜱蝇298只,通过形态学鉴定、PCR扩增羊蜱蝇18S rRNA基因进行虫体鉴定,并对病原巴尔通体的gltA基因进行检测,将部分阳性PCR产物连接pMD^TM-18T后转入DH5α感受态细胞,将阳性结果进行测序并进行遗传进化分析。结果显示,雌性阳性率49.8%(113/227),雄性阳性率42.3%(30/71),雌雄之间差异不显著(χ^2=0.944,P=0.267);羊蜱蝇携带病原巴尔通体的总感染率为48.0%(143/298),林芝极显著高于日喀则、那曲地区(χ^2=13.801,P<0.01;χ^2=17.067,P<0.01),日喀则和那曲地区无显著差异(χ^2=0.084,P=0.771);散养模式羊蜱蝇携带阳性率44.3%(102/230),圈养阳性率85.0%(34/40),屠宰场阳性率23.3%(7/30),宿主散养和圈养、屠宰场存在极显著差异(χ^2=20.929,P<0.01;χ^2=24.38,P<0.01),宿主散养和屠宰场存在显著差异(χ^2=3.989,P=0.046);将测序结果上传GenBank数据库获得3个巴尔通体gltA基因登录号(MN623006、MN623007、MN623008);序列比对表明和云南、新疆巴尔通体相似性为99.6%~100%。本次研究首次检测出西藏羊蜱蝇携带病原巴尔通体,为了解西藏绵羊体外寄生虫携带病原巴尔通体和病原防控提供依据。

gltA基因对粪肠球菌生物膜形成能力影响的初步研究

目的:探讨粪肠球菌(E.faecalis)谷氨酸合酶基因A(gltA)对生物膜形成的影响。方法:采用激光共聚焦扫描电镜(CLSM)观察临床分离的4株E.faecalis的生物膜形成能力、生物膜体积及活菌数;用RT-qPCR检测4株临床菌株的gltA基因表达水平的变化;构建gltA基因高表达E.faecalis菌株,以标准菌V583为对照,分别观察两者生长曲线的变化及24 h内的生物膜形成情况,同时检测其生物膜的体积及活菌数。结果:4株E.faecalis临床菌株均能形成结构致密的生物膜,其生物膜体积及其活菌数均显著高于标准株V583(P<0.05);4株临床菌株的gltA基因表达量均随着培养时间的增加而明显降低,在培养6、12 h时,4株临床菌株的gltA基因表达显著高于标准株V583(P<0.05);培养24 h时,4株临床菌株的gltA基因表达量与标准株V583相比无统计学差异(P>0.05)。gltA基因高表达株的生长速率与标准株相比无统计学差异(P>0.05);gltA基因高表达株生物膜形成较快,结构更加致密且厚度较厚,而标准株V583的生物膜形成较慢,较薄,且gltA基因高表达株在12、24 h时生物膜体积及其活菌数均显著高于对照组(P<0.05)。结论:gltA基因能在E.faecalis生物膜形成的早期阶段发挥关键的调控作用,是E.faecalis生物膜形成的重要基因。

吉林省林区蜱粒细胞无形体感染的调查

目的调查吉林省蜱粒细胞无形体感染。方法运用聚合酶链反应方法对吉林延边地区采集的蜱标本粒细胞无形体16S rRNA和gltA基因片段进行扩增及序列分析,将扩增序列与GenBank注册的基因序列进行比较,构建粒细胞无形体gltA基因进化树。结果共检测游离蜱427只,其中全沟硬蜱100只,森林革蜱327只,粒细胞无形体感染阳性率分别为4.00%和0.00%。寄生蜱感染阳性率2.9%。寄生蜱与游离蜱感染率差别无显著性。16S rRNA序列与我国已在GenBank注册的AF205140序列一致,与国外粒细胞无形体16S rRNA序列存在不同程度的差异,相似性为97%～99%;gltA基因与GenBank的粒细胞无形体gltA基因片段比较,相似性为87%～97%,推导的氨基酸序列相似性为84%～99%。结论我国吉林省林区存在蜱粒细胞无形体感染。

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan—MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针，以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板。在荧光定量PCR检测仪（ABI 7900HT）上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环闻值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．996）；与套式PCR相比较，荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本，检出结果几乎为0；对荧光定量PCR检测重复性进行分析，变异系数（CV）批内和批间误差在0-2．1％之间，证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本，结果与套式PCR检测结果有密切相关性，但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。

云南巴尔通体的系统发育多样性分析

目的基于gltA基因序列的系统发育分析对云南巴尔通体的多样性进行分析。方法用云南省1999年至今分离到的并已在GenBank中公布的32个巴尔通体变异体(gltA基因)为目标株,利用网上核酸序列比对程序BLAST进行核酸序列同源性搜索,调出相似性最高且有效发表种典型菌株为对比株,进行比对和系统发育分析。结果32个巴尔通体变异体可归为B.elizabethae、B.tribocorum、B.grahamii、B.washoensis、B.taylrii、B.phoceensis和B.yunnannensis7个分枝。同一枝中所有分离的变异体与其发育关系最密切且有效发表种典型的菌株间的gltA基因序列均有不同程度的差异。部分变异体与有效发表种典型的菌株间存在较大的遗传差异。结论云南巴尔通体菌不仅具系统发育多样性,而且还具有其特异性和可能有潜在的新种。一些不明原因的疾病有可能与巴尔通体的感染有关不容忽视。

恒河猴五日热巴尔通体的分离和柠檬酸合成酶基因的序列分析

目的初步研究巴尔通体在恒河猴体内的存在情况,并分析其柠檬酸合成酶(gltA)的基因序列,判断巴尔通体的种属。方法 16只来自福建的恒河猴,用血琼脂培养基分离可能存在的巴尔通体。根据NCBI数据库上的巴尔通体gltA的基因序列,设计一对引物,以巴尔通体菌落为模板进行扩增,将获得的序列进行克隆测序。结果从3只恒河猴体内成功分离到了巴尔通体病原,并获得了巴尔通体gltA全长基因序列,测序结果表明该序列与五日热巴尔通体同源性99%。结论福建来源的恒河猴种群携带巴尔通体病原,巴尔通体流行地区可能存在鼠与灵长类动物之间病原体的流行和传播。

从厩真厉螨中检出与猫立克次体近缘的立克次体核酸片段

本研究用立克次体属特异的gltA和ompB基因扩增引物，从吉林长白县捕获鼠中分拣的534只厩真厉螨中扩得gltA和ompB基因片段。通过基因片段的序列测定、BLAST比对和系统发育分析，显示两个扩增基因与猫立克次体Rickettsia fells同源性最高（99％），证明该地区厩真厉螨携带与猫立克次体近缘的立克次体。

黑龙江省口岸地区蜱类感染嗜吞噬细胞无形体Anaplasma phagocytophila的初步调查

为调查黑龙江省口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体Anaplasma phagocytophila感染情况,运用聚合酶链式反应方法扩增嗜吞噬细胞无形体柠檬酸合成酶（gltA）基因片段,对黑龙江省各口岸地区采集的蜱标本进行检测,并对阳性结果进行序列分析.共检测蜱1 609只,29只阳性,阳性率为1.80%,结果表明,黑龙江省口岸蜱类除日本血蜱外均有自然感染嗜吞噬细胞无形体的现象.所感染的嗜吞噬细胞无形体gltA 基因与GenBank 中登录的嗜吞噬无形体gltA基因片段,相似性为82%～98%.因此,我国黑龙江省口岸地区存在蜱粒细胞无形体感染.

东北林区鼠类粒细胞埃立克体感染的调查

目的了解东北林区啮齿动物感染粒细胞埃立克体病原体的情况。方法运用聚合酶链反应方法对吉林、黑龙江、内蒙古林区采集的啮齿动物标本粒细胞埃立克体的16S rRNA和gltA基因片段进行检测并测序，将所测序列与OenBank中注册的基因序列进行比较分析。结果共检测鼠标本276份，其中吉林长白山林区102份，黑龙江小兴安岭林区61份，内蒙古大兴安岭林区113份，阳性率分别为8．82％、1．64％及0．00％。体表有寄生蜱的鼠感染危险性是体表无寄生蜱鼠的11.30倍（P=0．002）。吉林、黑龙江林区鼠标本及其寄生蜱标本16SrRNA基因序列完全相同，与美国、瑞典、日本等国家检出的粒细胞埃立克体对应序列的同源性为97％～99％。gltA基因核苷酸序列与GenBank注册的相应片段比较相似性为87％～97％，推导的氨基酸序列相似性为84％～99％。结论吉林及黑龙江林区存在粒细胞埃立克体宿主动物感染。

2010-2011无年形我体国的东感北染林情区况蜱调中查嗜吞噬细胞

目的调查我国东北林区蜱标本中嗜吞噬细胞无形体的感染情况。方法2010-2011年在东北林区采集蜱标本,用聚合酶链反应方法扩增gltA基因片段,分析东北林区蜱中无形体的感染情况,代表阳性片段联用长片段16S rRNA进行扩增测序确认;并将所得序列与GenBank中已注册的序列进行比对分析。结果共检测蜱2293只,其中2010年1161只,阳性率4.91%,2011年1132只,阳性率4.24%,2年的感染率差异无统计学意义(χ2=0.373,P=0.830;χ2=1.789,P=0.409)。全沟硬蜱阳性率4.86%(91/1872),长角血蜱为3.41%(14/411),森林革蜱为0(0/10),3个蜱种的感染率差异无统计学意义(P>0.05)。测得的gltA序列中,NE-gltA-1与Hc346株(GenBank:GU935788)最相似,仅差2 bp,相似性99%;NE-gltA-2与MDJ-Ip92株(HQ396224)序列一致,相似性100%。与2个序列相似性最远的是ZJ-HGA-72株(DQ458811),相差53 bp,相似性84%。测得的16S rRNA序列与我国从东北鼠源分离株China-C-T(tGQ412339)最接近,相似性为99%,与Florida株(AF309867)相似性最远,相似性97%。结论我国东北林区蜱中普遍存在嗜吞噬细胞无形体的感染,全沟硬蜱和长角血蜱可能为无形体的媒介宿主。

微小牛蜱立克次氏体的检测

为利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术检测微小牛蜱体内携带立克次氏体的种类,无菌条件下提取微小牛蜱总DNA,以设计的引物RPCS.569P/RPCS.1262n和通用引物RPCS.877P/RPCS.1258GCn扩增立克次氏体gltA基因,DGGE电泳分离,选取条带进行回收克隆测序。结果表明:微小牛蜱之卵、饱血雌成蜱、半饱血雌成蜱、雄成蜱内均只含2种立克次氏体;测序、分析显示分离菌为立克次氏体属斑点热群。说明微小牛蜱具有潜在斑点热病源传播风险。

中国巴尔通体属系统发育多样性分析

目的通过对中国范围内分布的巴尔通体进行系统发育多样性分析,了解我国巴尔通体分布种类情况,可为临床诊断提供参考。方法下载GenBank中2000-2019年公布的中国范围内的巴尔通体gltA基因序列,采用CLUSTAL X 2.0进行多序列比对确定变异体,再在NCBI中在线采用Blastn策略同源性搜索与各变异体相似性最高且是有效发表种的gltA基因序列,作为参考序列,然后利用MEGA 7.0进行系统发育分析,构建系统发育树。结果中国的巴尔通体大致可归为25个种类,其中有11个种类可对人类致病,分别为B.henselae、B.quintana、B.elizabethae、B.clarridgeiae、B.grahamii、B.melophagi、B.rattimassiliensis、B.rochalimae、B.tribocorum、B.vinsonii、B.washoensis;还有27个变异体可能是潜在的新种。云南、黑龙江、新疆巴尔通体种类最丰富。结论中国巴尔通体种类丰富,可致人类患病的种类也较多,还有一些潜在新种,尤以云南、黑龙江、新疆等地的多样性最高,可为一些不明原因疾病的诊断提供参考。