电针介导AMPK/GFAT-1/VEGF对缺血性脑卒中小鼠脑血流量及运动功能的影响

目的观察电针“百会”“大椎”穴对缺血性脑卒中小鼠脑血流量及运动功能的影响,揭示腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶-1(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase-1,GFAT-1)/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分子通路参与电针减轻血管损伤,改善肢体运动功能的作用机制。方法将C57雄性小鼠随机分为假手术组、模型组、电针组,每组6只。采用光栓法制备缺血性脑卒中小鼠模型。采用走格子测试和爬杯实验评估小鼠运动功能;TTC染色和激光散斑血流成像仪评估脑梗死体积与脑血流灌注量变化;Western blot法检测AMPK、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、GFAT-1、VEGF的表达水平。结果与假手术组比较,模型组小鼠运动功能受损(P<0.05),脑梗死体积增加(P<0.05),脑血流灌注量减少(P<0.05),AMPK、p-AMPK、VEGF蛋白表达水平显著降低(P<0.05),GFAT-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组小鼠运动功能显著改善(P<0.05),脑梗死体积显著减小(P<0.05),脑血流灌注量显著增加(P<0.05),AMPK、p-AMPK、VEGF蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),GFAT-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论电针可能通过介导AMPK/GFAT-1/VEGF分子通路,参与改善脑皮质缺血所致脑血管损伤和运动功能障碍。

胰岛素抵抗及高血糖对GFAT活性的影响

分别观察了胰岛素抵抗和高血糖水平对己糖胺途径限速酶GFAT活性的影响.在alloxan高血糖小鼠模型中,与正常对照组比较,血清果糖胺水平升高了15.9%,肾组织GFAT活性升高了32.8%;经胰岛素治疗后,血清果糖胺水平降低了9.7%,其肾组织GFAT活性也降低了l9.4%.在高糖高脂饲料诱导的胰岛素抵抗的IR小鼠中,与同批正常对照组比较,正糖钳实验中稳态时葡萄糖输注率G IR值降低了69.3%,胰岛素耐量实验中的AUC值升高了38.1%,其肾脏组织GFAT活性也增加了26.6%.在胰岛素诱导的具有胰岛素抵抗的IR-H IR c细胞模型中,与正常H IR c细胞比较,其10、25 nmol/L胰岛素诱导的葡萄糖摄取能力分别降低了25.3%、21.1%,而GFAT活性分别增加了29.7%、46.5%.可见,GFAT活性与一段时间的平均血糖水平和胰岛素抵抗状态密切正相关.

谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰基转移酶抑制剂细胞筛选模型的建立

目的 建立己糖胺途径的关键酶谷氨酰胺∶6 磷酸果糖酰基转移酶(glutamine∶fructose 6 phosphateamidotransferase,GFAT)抑制剂的细胞筛选模型。方法 用改进的GDH法测定GFAT的活性。以速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取观察细胞对胰岛素的反应性;用长效胰岛素诱导HIRc细胞,形成己糖胺途径过度活跃和胰岛素抵抗的细胞模型,并应用该细胞模型和GDH法筛选GFAT抑制剂。结果 用25nmol·L-1长效胰岛素刺激HIRc细胞36h,可明显激活己糖胺途径,使GFAT活性上升47%;同时产生胰岛素抵抗,使速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取能力降低21%。Azaserine可明显抑制该模型中GFAT的活性。结论 长效胰岛素既可过度激活HIRc细胞己糖胺途径,又可使其产生胰岛素抵抗。该模型可用于筛选GFAT抑制剂。

人谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶的体外表达、纯化及活性检测

目的:制备重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT),检测其活性。方法:利用RT-PCR扩增人肝脏cDNA中GFAT1基因全长片段,克隆到表达载体pET32b中;在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT1;用体外酶学的方法检测GFAT的活性。结果:构建了pET32b-GFAT1质粒,经诱导表达及纯化,得到具有一定生物活性的GFAT。结论:利用原核表达系统可得到具有良好生物学活性的重组人GFAT1。

α-硫辛酸对糖尿病小鼠骨骼肌谷氨酰胺6磷酸果糖转氨酶1表达的影响

测定了四氧嘧啶制成的糖尿病小鼠模型骨骼肌的谷氨酰胺-6磷酸果糖转氨酶1(GFAT1)的mRNA表达水平。给予α硫辛酸治疗的糖尿病小鼠,骨骼肌内丙二醛水平低于不予治疗的糖尿病小鼠,而骨骼肌内GFAT-1的mRNA表达水平也低于不治疗组。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B的过度表达抑制GFAT的活性

为探讨蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)在细胞中的过度表达对氨基己糖途径之关键酶谷氨酰胺 :6 磷酸果糖酰基转移酶 (GFAT)的作用及其可能的作用机制。通过观察PTP1B在细胞内的过度表达对GFAT的活性及其终产物二磷酸尿嘧啶N 乙酰葡萄糖胺生成的影响及PTP抑制剂正钒酸盐的对抗作用 ,并测定对细胞内GFATmRNA水平和PTP1B对GFAT的直接作用等 ,发现PTP1B在L6、HepG2、3T3 L1和HIRc等细胞中的过度表达可明显抑制GFAT的活性 。

兔抗人谷氨酰胺果糖6磷酸氨基转移酶1(GFPT1)多克隆抗体的制备及应用

目的 制备特异性识别人谷氨酰胺果糖6磷酸氨基转移酶1(GFPT1)的兔多克隆抗体。方法 通过比对GFPT1及其高度同源的同工酶GFPT2的蛋白质序列,针对GFPT1的特异性序列设计并合成2个多肽,多肽与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联作为抗原免疫新西兰大白兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价。构建GFPT1和GFPT2的大肠杆菌表达载体,诱导表达获得GFPT1和GFPT2重组蛋白,通过Western blot法检测GFPT1和GFPT2重组蛋白以验证抗血清的特异性、免疫荧光细胞化学染色检测786-O细胞GFPT1的表达验证获得的抗血清能否识别内源性表达的GFPT1。结果 获得了特异性识别GFPT1的多克隆抗体,效价高达1∶1 458 000,该抗体可用于Western blot法以及免疫荧光细胞化学染色。结论 成功制备了特异性识别GFPT1的兔多克隆抗体。

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)是己糖胺通路(HBP)的限速酶,参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化。本研究利用RACE克隆了松墨天牛GFAT基因(Ma GFAT),Gen Bank登录号为KT362367,其长度为2624 bp,开放阅读框为2061 bp,编码686个氨基酸。序列对比分析显示Ma GFAT与赤拟谷盗相似性最高,为88%,在系统发育树上位于同一分支。采用RT-q PCR方法检测Ma GFAT在松墨天牛不同组织及不同发育时期的表达情况,结果表明:Ma GFAT在各虫态中,成虫中的表达量最高;在成虫部位中,翅的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的表达量最高。本文为研究GFAT结构与功能的关糸奠定基础,为阐明GFAT在松墨天牛几丁质合成中的作用提供参考。

胰腺癌组织中METTL14和GFPT1的水平表达与临床预后价值研究

目的研究胰腺癌组织中甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)及谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1,GFPT1)的表达及其临床意义。方法选取2017年4月~2019年4月上海交通大学附属第六人民医院诊治的86例胰腺癌患者为研究对象。利用实时定量PCR检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1 mRNA水平表达。利用免疫组织化学检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1蛋白表达。相关性分析采用Pearson相关分析及Spearman秩相关分析。比较不同胰腺癌患者METTL14和GFPT1蛋白表达与临床病理参数的关系。Kaplan-Meier生存分析胰腺癌组织中METTL14和GFPT1蛋白表达与患者生存预后的关系。单因素及多因素COX模型评价影响胰腺癌预后的因素。结果胰腺癌组织中METTL14 mRNA(5.442±0.437),GFPT1 mRNA(6.521±0.516)表达高于癌旁组织(0.992±0.203,0.895±0.212),差异具有统计学意义(t=85.644,93.525,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14(73.26%),GFPT1(69.77%)蛋白表达阳性率高于癌旁组织(8.14%,9.30%),差异具有统计学意义(χ^(2)=75.545,65.765,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14 mRNA与GFPT1 mRNA的表达呈明显正相关性(r=0.569,P<0.05);METTL14蛋白与GFPT1蛋白表达呈明显正相关性(r=0.664,P<0.05)。低分化程度(92.31%,88.46%)、AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(89.13%,86.96%)及有淋巴结转移(95.12%,92.68%)胰腺癌组织中METTL14,GFPT1蛋白表达阳性率分别高于高中分化程度(65.00%,61.67%)、AJCC分期Ⅰ期(55.00%,50.00%)及无淋巴结转移(53.33%,48.89%),差异具有统计学意义(χ^(2)=6.174~19.507,均P<0.05)。METTL14阳性表达组和GFPT1阳性表达组患者三年累积生存率分别低于METTL14阴性表达组,GFPT1阴性表达组(χ^(2)=15.232,18.054,均P<0.05)。肿瘤AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(OR=2.552,95%CI=1.420~4.455)、伴淋巴结转移(OR=1.754,95%CI=1.125~2.534)、METTL14阳性(OR=2.797,95%CI=1.233~5.876)、GFPT1阳性(OR=1.635,95%CI=1.030~2.506)是影响胰腺癌预后的独立危险因素。结论胰腺癌组织中METTL14,GFPT1表达升高,两者与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移有关,可用于评价胰腺癌患者生存预后。

肝细胞肝癌组织中miR-143-3p、GFPT2表达变化及意义

目的探讨肝细胞肝癌(HCC)组织中微小RNA-143-3p(miR-143-3p)、谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶2(GFPT2)的表达变化及临床意义。方法选取HCC患者106例,术中收集其HCC组织与癌旁正常组织(距离肿瘤边缘>5 cm)。用实时荧光定量PCR法检测组织中miR-143-3p、GFPT2 mRNA的表达,Pearson相关法分析HCC组织中miR-143-3p与GFPT2 mRNA表达的相关性,分析HCC组织中miR-143-3p、GFPT2 mRNA表达与患者临床病理特征的关系,Kaplan-Meier法分析miR-143-3p、GFPT2 mRNA表达与患者预后的关系。结果与癌旁正常组织比较,HCC组织中miR-143-3p相对表达量低(P=0.000),GFPT2相对表达量高(P=0.000)。HCC组织中miR-143-3p与GFPT2 mRNA表达呈负相关(r=-0.558,P=0.000)。HCC组织中miR-143-3p、GFPT2 mRNA表达与肿瘤门静脉侵犯、TNM分期有关(P均<0.05)。106例HCC患者随访2~60(32.7±6.5)个月,随访期间死亡65例。以HCC组织中miR-143-3p相对表达量均数0.843为临界值,分为miR-143-3p高表达组51例、miR-143-3p低表达组55例。与miR-143-3p高表达组比较,miR-143-3p低表达组5年总体生存率(OS)低(P=0.012),生存时间短(P=0.000)。以HCC组织中GFPT2 mRNA相对表达量均数1.623为临界值,分为GFPT2高表达组52例、GFPT2低表达组54例。与GFPT2低表达组比较,GFPT2高表达组5年OS低(P=0.000),生存时间短(P=0.000)。结论HCC组织中miR-143-3p低表达,GFPT2高表达;二者均参与HCC的发生发展,并影响患者预后。

谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1相关性肢带型先天性肌无力综合征二例临床分析

目的 观察2例谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1（GFPT1）相关性肢带型先天性肌无力综合征患者的临床、电生理及病理改变特点.方法 收集于2014年3月和2014年6月就诊于北京大学第一医院神经内科并诊断为GFPT1相关性肢带型先天性肌无力综合征的2例患者,回顾性分析2例患者的临床资料、实验室、电生理、肌肉病理及基因检查结果,总结本病的临床特点,并随访其治疗效果.结果 例1男性,16岁,活动后易疲劳10年.例2男性,9岁,活动后易疲劳6年.2例患者体检均显示四肢近端肌力Ⅳ级.例1血清肌酸激酶轻度升高（224 IU/L）,例2正常.例1、例2腋神经3 Hz重复神经电刺激复合肌肉动作电位波幅分别递减46.9％、17.5％.2例患者血清乙酰胆碱受体抗体水平均正常,给予溴吡斯的明治疗后症状均得到明显改善.例1骨骼肌内可见肌纤维内大量管聚集,例2Ⅰ型肌纤维病理占优势.2例患者经GFPT1基因检查均存在2个复合杂合突变,例1分.别为p.Y367C和p.G564C,例2分别为p.G26S和p.V291I.结论 GFPT1相关性肢带型先天性肌无力综合征多为儿童期起病,以波动性肌无力、肢带型肌无力为主要表现,低频刺激下波幅递减、肌肉病理出现管聚集可作为诊断线索.胆碱酯酶抑制剂为治疗本病的首选药物.