甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的克隆表达及其性质研究

目的:利用甜叶菊糖基转移酶UGT76G1特异性催化甜菊糖中含量高并且具有较强后苦味的甜菊甙生成高甜度的莱鲍迪甙A。方法:将合成的UGT76G1编码基因插入pYES2载体的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,成功构建了pYES2-UGT重组质粒。重组质粒导入表达宿主酿酒酵母YPH499中,利用2%半乳糖对重组菌进行诱导表达。结果:确定了最佳诱导时机为菌体培养后48h,诱导表达时间为12h。并对重组酶粗酶液性质进行了初步研究,确定其最适反应pH为8.0,最适反应温度为40℃,最佳反应时间为36h。结论:为建立经济高效的生物催化法对甜菊糖口味改质奠定了基础。

酿酒酵母组成型表达甜叶菊糖基转移酶UGT76G1及相关性质研究

本研究将酿酒酵母穿梭质粒p ESC-Leu的诱导型启动子GAL1和GAL10分别替换为PGK1和TEF1启动子,构建了组成型双启动子表达载体p ESCD,再将甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的编码基因亚克隆到p ESCD的Sal I和Xho I酶切位点之间,构建了组成型表达UGT76G1的重组质粒p ESCD-UGT。将p ESCD-UGT转化到酿酒酵母YPH499中进行表达,结果确定该重组酵母在SD-L液体培养基培养24h达到稳定期,菌体培养8h蛋白表达量高,选用1%的甲苯作为重组菌全细胞催化的通透剂时,催化15h产生288mg/L的莱鲍迪甙A,其产量是对照组的5倍。

重组酿酒酵母全细胞催化合成莱鲍迪苷A

用经密码子优化后合成的甜叶菊UDP糖基转移酶UGT76G1编码基因构建了表达该酶的重组酿酒酵母YPH499(pYES2-UGT)。建立了通过柠檬酸钠调节酿酒酵母细胞内由葡萄糖到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的代谢通量,用于催化甜菊苷合成莱鲍迪苷A的全细胞催化方法。优化后的催化体系为:甜菊苷1 g/L,葡萄糖20g/L,普郎尼克F68 10 g/L,MgCl2 6 g/L,柠檬酸钠15 g/L,pH 7.2,细胞密度200 g湿细胞/L反应液,在37℃下经72 h后转化生成莱鲍迪苷A 267.89 mg/L。