GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响

目的 :观察葡萄糖、胰岛素诱导K5 6 2细胞GPI PLD基因表达对GPI锚定CD5 5 ,CD5 9的影响 ,以及对补体依赖的细胞毒 (complementdependentcytotoxicity ,CDC)杀伤K5 6 2细胞的影响。方法 :采用免疫印迹检测CD5 5和CD5 9表达 ,定量测定GPI PLD酶活性 ,台盼蓝排斥法观察CDC杀伤率。结果 :诱导 2 4h及 4 8h ,胰岛素组、葡萄糖 +胰岛素组酶活性、杀伤率明显增高。 2 4h时对照组、葡萄糖组、胰岛素组膜蛋白检出CD5 5 ,对照组、葡萄糖组膜蛋白及胰岛素组、葡萄糖 +胰岛素组培养基中检出CD5 9。 4 8h时对照组膜蛋白 ,葡萄糖组、胰岛素组、葡萄糖 +胰岛素组培养基检出CD5 5 ,CD5 9。结论 :胰岛素诱导使K5 6 2细胞的GPI PLD酶活性明显升高 ,导致GPI锚定CD5 5和CD5 9释放进入培养基 ,K5 6

GPI-PLD通过下调PI3K-Akt信号通路活性抑制肝癌细胞的生长

目的:明确糖基化磷脂酰肌醇特异性磷酯酶D(glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase D,GPIPLD)对肝癌细胞HepG2的影响以及可能的调控分子机制。方法:通过转染构建高表达GPI-PLD模型,利用M、荧光染色以及Western印迹检测高表达GPI-PLD对肝癌细胞的影响,同时接种于裸鼠模型中,进一步明确GPI-PLD在体内对肝癌细胞的影响。结果:与空白组和对照组相比,GPI-PLD组PI3K-Akt信号通路活性明显受到抑制,肝癌细胞增殖活性明显受到抑制并呈现典型的凋亡形态。肝癌裸鼠模型结果显示GPI-PLD组肿瘤的生长速度、肿瘤质量[(1.87±0.09)g]小于空白组[(2.20±0.17)g]和对照组[(2.15±0.09)g],GPI-PLD组AST,ALT,AFP血清浓度显著低于空白组和对照组(P<0.05)。结论:GPI-PLD可通过下调PI3K-Akt信号通路活性,抑制肝癌细胞的增殖及体内生长,促进肝癌细胞的凋亡。

GPI-PLD过表达对肝癌细胞株HepG2生物学特征的影响

目的:研究GPI-PLD基因转染并过度表达对HepG2细胞的影响。方法:用脂质体转染法将本室已经构建的GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为对照,G418筛选出阳性细胞克隆。用自制具完整GPI结构的胎盘碱性磷酸酶为底物,定量检测GPI-PLD活性,RT-PCR法确定GPI-PLD mRNA表达水平。细胞计数绘制生长曲线,荧光染色观察HepG2细胞形态学改变,流式细胞术检测凋亡,台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒(CDC)杀伤率,ELISA检测癌胚抗原(CEA)的表达情况。结果:阳性细胞克隆GPI-PLD酶活性水平比对照组升高约2倍,GPI-PLD mRNA表达水平约增加5倍;GPI-PLD基因过度表达可促进GPI锚定的蛋白质如CEA和PLAP等被大量水解释放入培养基,导致细胞增殖能力减弱,对补体杀伤的敏感性增强,细胞呈现典型的凋亡形态特征,流式细胞术检测到凋亡峰,细胞凋亡率明显增加。结论:成功将GPI-PLD基因转染入HepG2细胞,并在细胞中稳定表达。GPI-PLD过表达能抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性。

rhPLD2与GPI-PLD的比较生物学信息分析

采用Vector NTI、DNATools等计算机分析软件及信息库对人重组磷脂酶D2(rhPLD2)与糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)进行比较生物学信息分析。rhPLD2不仅保留有PLD2的重要生物学活性和功能,而且可能可作为分泌型GPI-PLD蛋白的活性竞争分子,从而在炎症反应性疾病中发挥重要作用。

人骨髓基质细胞中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶DcDNA的克隆

为探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)cDNA的结构及功能 ,应用RT PCR从人骨髓基质细胞中克隆了长约 2 6kb的GPI PLDcDNA ,包含完整阅读框架 ,编码 2 3个氨基酸的信号肽及 817个氨基酸的成熟肽 .该cDNA与人胰腺GPI PLDcDNA几乎百分之百同源 ,与人肝脏GPI PLDcDNA同源性为 95 %,氨基酸同源性为 94 %,3者对应的结构基因只有 1个 ,位于人类第 6号染色体上 ,基因组序列长约 80kb ,包括 2 5个外显子 .构建克隆的GPI PLDcDNA的真核表达载体 ,通过脂质体转染能表达GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)而无GPI PLD活性的G9细胞 ,同时设立对照组检测GPI PLDcDNA的功能 .结果显示 ,对照组细胞几乎检测不到GPI PLD活性 ,其表达的PLAP主要位于细胞膜上 ;而转染GPI PLDcDNA的G9细胞能检测到较高水平的GPI PLD活性 ,而且大部分酶活性存在于培养液中 ,其表达的PLAP也主要被释放入培养液 .结果证实 ,从人骨髓基质细胞中克隆的GPI PLDcDNA有生物学功能 ,它能释放细胞膜上GPI锚定蛋白质 .

维甲酸对肝癌细胞HepG2糖基化磷脂酰肌醇特异性磷酯酶D表达及细胞生物学特性的影响

应用MTT、流式细胞仪、免疫印迹法检测全反式维甲酸(ATRA)单独或联合糖基化磷脂酰肌醇特异性磷酯酶D(GPI-PLD)特异性抑制剂1,10-二氮杂菲对肝癌细胞HepG2生物学特性的改变.ATRA使肝癌细胞HepG2 GPI-PLD基因表达及酶活性上调,并呈现剂量和时间依赖性.ATRA可抑制肝癌细胞HepG2增殖,使肝癌细胞Caspase-3表达水平显著增加,Bcl-2表达水平下调,促进肝癌细胞凋亡(P<0.05).ATRA联合1,10-二氮杂菲诱导组细胞,Bcl-2、细胞增殖活性较ATRA单独诱导组显著增强,Caspase-3、凋亡率显著下降.维甲酸可促进肝癌细胞HepG2 GPI-PLD基因表达上调,高活性的GPI-PLD有助于维甲酸抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡.

血清糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的检测

利用自制的、具完整糖基化磷脂酰肌醇（ＧＰＩ）结构的胎盘型碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）做底物，通过聚乙二醇／葡聚糖分相系统定性，ＴＸ１１４分相定量，初步建立了检测人血清中ＧＰＩ特异性磷脂酶Ｄ（ＧＰＩＰＬＤ）的方法，并对酶促反应的某些动力学性质进行了探讨。该方法重现性好（ＣＶ＝３．６％），灵敏度高（血清用量２μｌ即可），且经济、实用，有一定的推广价值。用该方法检测１００名正常人血清，表明其ＧＰＩＰＬＤ的活性范围为３０％～５０％（用转化底物的百分率表示）。