重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体p ET30a(+)连接构建表达质粒p ET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体p CDFDute-1连接构建表达质粒p CDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内。经异丙基-?-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 k D的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。